1、实验 49 过氧化氢酶的活性测定 植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使 H 2 O 2 累积。 H 2 O 2 可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除 H 2 O 2 ，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中 过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。 高锰酸钾滴定法 一、原理 过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和分子氧，可根据 H 2 O 2 的消耗量或 O 2 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的 H 2 O 2 溶
2、液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的 H 2 O 2 ，即可求出消耗的 H 2 O 2 的量。 5H 2 O 2 +2KMnO 4 +4H 2 SO 4 5O 2 +2KHSO 4 +8H 2 O+2MnSO 4 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 植物叶片。 （二）试剂 1 10 H 2 SO 4 。 2 0.2 mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8 。 3 0.1 mol/L 高锰酸钾标准液：称取 KMnO 4 （ AR ） 3.1605 g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000 mL ，用 0.1 mol/L 草酸溶液标定。 4 0.1 mol/L H
3、2 O 2 ： 30 H 2 O 2 大约等于 17.6 mol/L ，取 30 H 2 O 2 溶液 5.68 mL ，稀释至 1000 mL ，用标准 0.1 mol KMn0 4 溶液（在酸性条件下）进行标定。 5 0.1 mol/L 草酸：称取分析纯 H 2 C 2 O 4 2H 2 O 12.607 g ，用蒸馏水溶解后，定容至 1000 mL 。 （三）仪器设备 研钵， 50 mL 三角瓶 14 个， 10 mL 酸式滴定管，恒温水浴锅， 25 mL 容量瓶 1 个。 三、实验步骤 1 酶液提取 称取小麦叶片 2.5 g 加入 pH7.8 的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至 2
4、5 mL 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容， 4000 r/min 离心 15 min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 2 取 50 mL 三角瓶 4 个（ 2 个测定， 2 个对照），测定瓶中加入酶液 2.5 mL ，对照瓶中加入煮死酶液 2.5 mL ，再加入 2.5 mL 0.1 mol/L H 2 O 2 ，同时计时，于 30 恒温水浴中保温 10 min 后，立即加入 10 H 2 SO 4 2.5 mL 。 3 用 0.1 mol/L KMnO 4 标准溶液滴定 H 2 O 2 ，至出现粉红色（在 30 min 内不消失）为终点。 四、结果计
5、算 酶活性用每克鲜重样品 l min 内分解 H 2 O 2 的毫克数表示： 酶活 mg/ （ g ? min ） = 式中： A 对照 KMnO 4 滴定毫升数（ mL ）。 B 酶反应后 KMnO 4 滴定毫升数（ mL ）。 V T 酶液总量（ mL ）。 1.7 l mL 0.1 mol/L 的 KMnO 4 相当于 1.7 mg H 2 O 2 。 FW 样品鲜重（ g ）。 V 1 反应所用酶液量（ mL ）。 t 反应时间（ min ）。 注意：所用 KMnO 4 溶液及 H 2 O 2 溶液临用前要经过重新标定。 紫外吸收法 一、原理 H 2 O 2 在 240nm 波长下有强
6、吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（ A 240 ）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 小麦叶片或其他植物组织。 （二）试剂 1 0.2 mol/L pH7.8 磷酸缓冲液（内含 1 聚乙烯吡咯烷酮）。 2 0.1 mol/L H 2 O 2 （用 0.1 mol/L 高锰酸钾标定）。 （三）仪器设备 紫外分光光度计，离心机，研钵， 25 mL 容量瓶 1 个，刻度吸管 0.5 mL 2 支， 2 mL 1 支， 10 mL 试管 3 支，恒温水浴锅。 三、实验步骤 1 酶液提取 称取新鲜小麦叶片或其
7、他植物组织 0.5g ，置研钵中，加 2 3mL 4 下预冷的 pH7.8 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入 25 mL 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并缓冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将容量瓶置 5 冰箱中静置 l0 min ，取上部澄清液在 4000 r/min 下离心 15 min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液， 5 下保存备用。 2 测定 取 l0mL 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管， 1 支为空白管（将酶液煮死），按表 49 1 顺序加入试剂。 表 49-1 紫外吸收待测样品测定液配制表 管 号 试 剂（酶） S0 S1 S2 粗酶液（ mL ） 0.2 0.
8、2 0.2 pH7.8 磷酸缓冲液（ mL ） 1.5 1.5 1.5 蒸馏水（ mL ） 1.0 1.0 1.0 25 预热后，逐管加入 0.3 mL 0.1 mol/L 的 H 2 O 2 ，每加完 1 管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240 nm 下测定吸光度，每隔 l min 读数 1 次，共测 4 min ，待 3 支管全部测定完后，计算酶活性。 四、结果计算 以 1 min 内 A 240 减少 0.1 的酶量为 1 个酶活单位（ u ）。 过氧化氢酶活性 u / （ g min ） = 式中： A 240 A S0 （ A S1 +A S2 ） /2 。 A S0 加入煮死酶液的对照管吸光度。 A S1 、 A S2 样品管吸光度。 V t 粗酶提取液总体积（ mL ）。 V 1 测定用粗酶液体积（ mL ）。 FW 样品鲜重（ g ）。 0.1 A 240 每下降 0.1 为 1 个酶活单位（ u ）。 t 加过氧化氢到最后一次读数时间（ min ）。 注意：凡在 240 nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。 思考题 影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？
