1、过氧化物酶活性测定 一 实验目的 学习和掌握过氧化物酶 POD 活性测定的原理及方法 二 实验原理 在通常情况下 需氧生物在还原氧至水的过程中会产生氧气 植物细胞中电子传递不通畅时 会产生一系列活性氧 超氧阴离子自由基 羟自由基 单线态氧 过氧化氢 会直接或间接启动膜脂过氧化作用 导致膜的损伤和破坏 过氧化物酶广泛存在于植物体中 是生物体内存在的一种防护氧自由基对细胞膜系统伤害的酶 在细胞膜产生过氧化物的破坏有保护作用 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化 过氧化物酶能催化过氧化氢氧化酚类 产物为醌类化合物 此化合物进一步缩合或与其他分子缩合 产生颜色较深的化合物 本实验是以邻甲氧基苯酚
2、即愈创木酚 为过氧化物酶的底物 在该酶存在下 H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4 邻甲氧基苯酚 其反应为 该红棕色的物质在波长470nm处有最大光吸收 故可通过测470nm处的吸光度变化来测定过氧化物酶的活性 器材与试剂 1实验仪器 分光光度计 离心机 秒表 天平 研钵 2实验试剂 50mmol L磷酸缓冲液 50mmol L愈创木酚溶液 2 过氧化氢 3实验材料 小麦 营养液 盐胁迫 实验步骤 1 粗酶液的提取称取植物材料0 5g 加5ml50mmol L磷酸缓冲液 于研钵中研磨成匀浆 以4000r min离心15min 残渣再用5ml磷酸缓冲液提取一次 合并两次上清液 25ml容量瓶定溶 保存在冷处 2 酶活性的测定取光径1cm比色杯2只 于1只中加入磷酸缓冲液1ml 50mmol L愈创木酚溶液1ml 2 过氧化氢1ml 作为校零对照 另一只加入50mmol L愈创木酚溶液1ml 2 过氧化氢1ml 上述酶液1ml 如酶活性过高可适当稀释 立即开启秒表计时 于分光光度计470nm波长下测量OD值 每隔1min读数一次 以每分钟OD变化值表示酶活性大小 即以 A 稀释倍数 min 鲜重g 表示 注意事项 酶的提取需要在低温下进行
