1、分 类 号 R445.5 密 级 学校代码 10367UDC 616 编 号 学 号 2011673109299mTc-NT21MP 在乳腺癌小鼠显像中的实验研究The experimental study of 99mTc-NT21MP inimaging of breast cancer mouse论文类别：专业学位型作 者 姓 名 李辉 指导教师姓名 孙俊杰申请学位级别 硕 士 学位授予单位 蚌埠医学院学 科 专 业论文答辩时间影像医学与核医学2014 年 5 月研 究 方 向学位授予日期分子核医学2014 年 6 月答辩委员会主席：论 文 评 阅 人：2014 年 4 月刘斌硕 士 学
2、 位 论 文论 文 题 目： 99mTc-NT21MP 在乳腺癌小鼠显像中的实验研究The experimental study of 99mTc-NT21MP inimaging of breast cancer mouse研 究 生 姓 名 : 李辉指学研导科究教专方师 :业 :向 :孙俊杰副教授影像医学与核医学分子核医学论文工作时间 : 2012 年 03 月至 2014 年 03 月目 录中文摘要 . 1英文摘要 . 2引 言 . 4主要材料与仪器 . 7实验方法 . 8结果与分析 . 11讨结论 . 18论 . 22参 考 文 献 . 23致 谢 . 26附录 A . 27附录 B
3、. 28附录 C、综述 . 29参考文献 . 36论文，题目：学 位 论 文 原 创 性 声 明本人郑重声明，本学位论文是由本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。对本论文的研究过程中给予帮助的其他人士，以及论文撰写中所提供的建议等的贡献也已作了致谢说明。本人完全理解本声明的法律责任，以及所涉及的结果将由本人承担。学位论文作者签名：日期： 年 月 日关于学位论文著作权的共享声明根据中华人民共和国著作权法和高等院校知识产权管理条
4、例，本学位99mTc-NT21MP 在乳腺癌小鼠显像中的实验研究，是研究生在导师指导下完成的职务作品，得到蚌埠医学院相关部门科室的物质技术和经费支持，因此，本学位论文的著作权由研究生，导师和蚌埠医学院三方共同享有，均享有署名权和使用权等权益；本学位论文成果归属蚌埠医学院。根据国家学位授予条例，学校对本学位论文有使用权，包括保存本学位论文；因教学和科研的目的，保留在图书馆被查阅或借阅；学校可根据国家规定将本学位论文送交国家有部门保留和使用。学校在公布本学位论文的全部或部分内容时，应保障研究生和导师的署名权等权益。研究生和导师在公开发表本学位论文的全部或部分内容时必须保障学校的署名权等权益，即在发
5、表论文时蚌埠医学院及相关部门科室应署名为作者单位。声明人完全理解本声明的法律责任。研究生签名： 导师签名：日期Tc-NT21MP 在乳腺癌小鼠显像中的实验研究99m摘 要目的：探索具有较高放化纯度和良好稳定性的99mTc直接标记趋化因子受体4（chemokine receptor4 CXCR4）配体NT21MP（来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白-N端多肽）的方法，并筛选最佳标记条件，找到一种简便可行的99mTc-NT21MP标记方法；为99mTc-NT21MP的受体显像提供实验依据；探讨99m Tc-NT21MP作为CXCR4阳性乳腺癌SPECT显像剂的可行性。方法： 用预锡化法99mTc 直接标记
6、NT21MP，选出较放化纯度大于 90%的标记方法；另外，标记结束后，把标记产物分别加入到室温生理盐水中和37健康成人血浆中，用纸层析法，在不同时间点测定并计算标记产物的标记率及放化纯度，观察标记物体内外稳定性；建立荷乳腺癌小鼠模型；把制备好的99mTc-NT21MP经荷瘤鼠尾静脉注射到荷瘤鼠（乳腺癌）体内，在SPECT机上显像，并利用ROI技术测出注射标记物后0.5h、1h、2h的T/NT（target/non-target，T/NT）放射性计数比值；显像两天后，再次从荷瘤鼠尾静脉注射定量的99mTc-NT21MP，2小时后采用短头法处死荷瘤鼠，取肿瘤组织及主要脏器，测定并计算出每克组织内的
7、放射性剂量摄取率（%ID/g）及T/NT 比值；结果：预锡化法标记99mTc- NT21MP放化纯度可达93.4%；血浆中2h内稳定，放化纯度接近90%；99m Tc-NT21MP在荷瘤鼠体内使肿瘤区在 SPECT机上显像，并且测得2小时内的T/NT最高比值为6.0。99m Tc-NT21MP注射荷瘤鼠体内后能靶向肿瘤组织，2小时的T/NT最高比值为2.4。结论：99mTc-NT21MP制备简单、方便、快速，所得99m Tc-NT21MP放化纯度较高，无需进一步纯化，且稳定性较好；99mTc-NT21MP注入荷瘤鼠体内使肿瘤区显像清晰，图像质量好；99mTc-NT21MP 在CXCR4阳性肿瘤
8、的诊断中具有较高的应用价值，有望作为一种新型分子探针监测乳腺癌的发生发展。关键词：靶向；肿瘤； CXCR4受体；分子影像1Tc with relatively high radiochemical purity and stability, screening the bestTc-NT21MP;Explore the possibility and feasibility of Tc-NT21MP targetingTc-NT21MP at2 h later and killed tumor-bearing mice. blood and major organsTc-NT21MP was
9、95%. It was stable inTc-NT21MP was injected in tumor-bearingTc-NT21MP is simple, rapid, radiochemical purity productThe experimental study of 99mTc-NT21MP in imaging ofbreast cancer mouseAbstractObjective：To explore the method of direct radio-labeling of chemokine receptor4(CXCR4) inhibitor derived
10、from virus macro-phage inflammatory protein(NT21MP)by 99mlabeling conditions, to establish a simple and reliable method of preparation of99m 99mdiagnosis of malignancy, providing theoretical and experimental basis for the study oftumor CXCR4 receptor imaging. Detect the value of 99mTc-NT21MP as brea
11、st-positiveSPECT imaging agent.Methods: NT21MP was directly radio-labeled by 99mTc using pretinning method,the selection of a higher rate and tag marking methods radiochemical purity；99mTc-NT21MP were placed in saline at room temperature and normal human serumat 37, the paper chromatography measured
12、 at different time and calculate the rate oflabeled product and the radiochemical purity of labeled, in vivo observation of itsstability, and comparative analysis of selected optimal condition; To establish thetumor models of breast cancerSPECT imaging of model mice were detected byintravenous injec
13、tion 99mTc-NT21MPT/NT value was calculated at 0.5h, 1h, and 2 hafter injection of the radiotracerTwo days after imaging, tail vein injection of the99mwere determined and calculated per gram Organization percentagerate(% ID/g)radiation doseResults: The radiochemical purity of 99mblood plasma within 2
14、 hours; its radiochemical purity was nearly 90%. It makestumor area imaged on SPECT when 99mmice and T/NT reaches 6.0 in 2 hours. 99m Tc-NT21MP could target to tumor tissuesafter injecting. T/NT reached 2.4 in 2 hours.Conclusions: 99mobtained higher marks, better stability, no further purification;
15、it makes clearly and2Tc-NT21MPquality pictures when 99m inject into tumor-bearing mice.99mTc-NT21MP has a high value in the diagnosis of CXCR4 positive tumors, and itmay become a new molecular probe for the diagnosis and therapy of breast cancer.Key words: target; tumor; CXCR4; molecular imaging3引 言
16、乳腺癌是西方发达国家女性最常见的恶性肿瘤，我国原为乳腺癌低发国家，但是近年来受饮食习惯西化、生活环境的变化及其他因素的影响，发病率迅速增高，尤以大城市为著。乳腺癌的发病率每年都在升高，现已居女性恶性肿瘤的首位，且发病年龄越来越年轻化，对女性的健康和生命有严重的危害。但是如果能做到早期诊断、早期治疗，乳腺癌病人的死亡率明显减低。有文献报道：如果能及时诊治，早期乳腺原位癌的 5 年生存率是非常理想的。因此，早期诊断对治愈乳腺癌具有重要的价值，也是降低病人死亡率，改善患者预后以及提高病人生活质量的主要途径。但是，由于大部分乳腺癌患者在早期没有明显的临床症状及体征，除了进行常规的临床体格检查外，很少进
17、行常规的影像学检查，等到发现病灶时，多数已属中晚期。一般影像学检查只能从形态学上发现肿瘤病灶，并且受检查设备分辨率的限制，远不能满足临床上对于早期发现及诊断肿瘤的需要。对于临床隐匿性乳腺癌病灶的早期诊断，特别是分子影像学临床应用以来，在乳腺癌的早期检出和诊断方面发挥着重要作用1。趋化因子是一类小分子分泌蛋白，能够与其特异性受体结合从而发挥作用，到目前为止，已经发现的趋化因子有 50 多种2。根据 N-末端半胱氨酸残基的数量及空间结构不同，人为的把趋化因子分为：-CXC（ a 趋化因子），CC（e 趋化因子），C（Y 趋化因子）和 CX3C（S 趋化因子）-四类，趋化因子受体的分类是基于其配体的
18、类型，故相应的趋化因子受体也分为 CXCR、 CCR、CR、CX3CR 四类3。CXCL12又称为基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1），是一种小分子量(8-10KDa) 细胞因子，属于趋化因子 CXC 亚家族。近年来研究发现趋化因子CXCL12 存在两种受体：趋化因子受体 4 （chemokine receptor 4 CXCR4）和趋化因子受体 7 （chemokine receptor 7 CXCR7）4。CXCR7 广泛表达于脑、脾、肾、软骨、心脏和多种肿瘤细胞系，同时在肿瘤的发生发展分子机制中起重要作用，在CXCL12 调控的生
19、命过程中发挥着与 CXCR4 不尽相同但又相互协调的重要作用5；但是作用最广泛的当属 CXCL12/CXCR4 轴6 ，它与 CXCL12 有高度亲和力，两者特异性结合后形成 CXCL12/CXCR4 轴广泛参与体内多种病理及生理过程。CXCR4由 352 个氨基酸组成，高度保守，是一类含有 7 个跨膜区的 G 蛋白耦联受体（GPCR ）。属于细胞内的趋化因子受体，能够与异三聚体 G 蛋白偶联，从而调节细胞内信号配4体的级联反应。在人体内，编码基因位于人染色体 2q21，有 1 个胞外 N 端，3 个胞内环，3 个胞外环和 1 个胞内 C 端，CXCL12 与 CXCR4 的 N 端结合才能启
20、动下游信号通路。CXCR4 在包括结直肠癌 7、乳腺癌8、非小细胞肺癌9、黑色素瘤10等多种实体瘤细胞中也高表达，且与肿瘤的生长及器官特异性转移密切相关。Muller 等9于2001 年首次报道了人乳腺癌细胞系、乳腺癌原发灶及转移灶均高表达 CXCR4 受体。最初的研究认为11：CXCR4 在乳腺癌细胞的主要功能是，在循环系统中 CXCR4阳性的癌细胞靶向、特异的转移到表达 CXCL12 的靶器官，比如肺、肝、淋巴组织和骨髓。在动物实验过程中， Orimo 等人发现 12 ：局部及系统的乳腺癌转移能够被抗 CXCR4 抗体有效地降低，通过 Orimo 等人的实验，已证实 CXCR4/CXCL1
21、2轴具有以下几方面的功能：乳腺癌细胞的生长能够被 CXCR4 的活化所促进（此方式称为 CXCL12 的旁分泌功能）；，CXCL12 还可以通过另外一种方式促进肿瘤生长，即 CXCL12 通过内皮干细胞进入肿瘤组织，从而形成肿瘤血管（此方式称为 CXCL12的内分泌）。另外有研究表明13：CXCL12 可被基质成纤维细胞组成型分泌，并且释放到肿瘤微环境中去。Li YM 等14还发现，肿瘤细胞表达 CXCR4 水平的高低与乳腺癌患者的生存率呈负相关性。在肿瘤的发生、发展过程中，常常会引起基因水平的变化，从而导致肿瘤细胞膜上的某些受体会高水平表达。这就为我们核医学在早期诊断及早期治疗肿瘤方面提供了
22、良好的工具，也是核技术不可替代的原因。尤其是随着分子影像技术的快速发展及不断成熟，人们可以从分子水平，甚至是亚分子水平去研究和认识肿瘤的发生、发展。肿瘤受体显像就是其研究领域之一。众所周知，配体与受体结合不但具有高选择性、高特异性，并且还具有高亲和力等特点，这是核技术在医学方面应用的基础之一。用放射性核素（18F、99m Tc、68Ca 等）标记的配体作为示踪剂，使之与在肿瘤细胞表面高水平表达的相关受体相结合，再利用特定探测器探测放射性核素放出的射线，从而使肿瘤得以显像。已经用于临床的肿瘤受体显像有：生长抑素受体（somatostatin receptor, SSTR）显像；类固醇激素受体显像
23、；血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）受体显像；肝受体显像；多巴胺受体显像等。与单克隆抗体相比，小分子多肽具有良好的稳定性，从而日益受到研究人员的重视，在肿瘤的临床应用中，将来有可能成为一个全新的、重要的方向15。随着分子影像技术的不断发展及成熟，乳腺癌核技术显像的方法日益增多，如 18-氟-脱氧5Tc葡萄糖（18F-FDG ），它作为葡萄糖结构类似物能反应肿瘤细胞内糖代谢情况，并且肿瘤细胞的恶性程度与肿瘤的 FDG 摄取成正相关，即 FDG 摄取越明显，肿瘤的恶性程度越高16。但是，此种显像方法无法判断趋化因子受体 4（CXCR4）在肿瘤表面表
24、达的情况。CXCR4 显像应用于肿瘤诊断的基础是肿瘤细胞 CXCR4 表达量的多少，以及其同配体结合的特异性高低。本研究选用预锡化法直接标记巨噬细胞炎性蛋白（viral macro-phage inflammatory protein- ,vMIP-）N 端 21 个氨基酸的多肽（NT21MP）。99m Tc 直接标记 NT21MP 结束后，用纸层析法测定并计算标记产物的标记率及放化纯度；把标记物放入常温（25）生理盐水中和 37健康成人血浆中（模拟人体环境），观测标记物在人体内外的稳定性，并通过比较分析筛选出具有较高放化纯度和良好稳定性的标记方法及其最佳标记条件；本实验介绍了 99m直接标记 G-蛋白偶联受体 CXCR4 的配体 NT21MP 的发展，并且通过在小鼠体内建立乳腺癌模型，初步证明了作为 CXCR4 表达的体内显像的可能性。该配体提供了一种用来作为最初诊断工具的可能性。同时，为以后进一步的研究提供实验依据。6
