1、 本 科 毕 业 论 文重组表达质粒 pPIC9K-mSBD-1 的构建The re-construction of pPIC9K-mSBD-1学 院：兽医学院专 业：动植物检疫姓 名：郑佳琪学 号：090115052指导教师：曹贵方职 称：教授论文提交日期：二 一三年六月摘 要研究发现，-防御素主要由哺乳动物的皮肤、黏膜等上皮细胞产生，由 3842 个氨基酸组成。其分子中带有较多正电荷，空间结构分为疏水区和带点区；折叠形成 3 束 -折叠片层结构，由 6 个保守的半胱氨酸残基形成 3 个二硫键稳定结构，由 Cysl-Cys5、Cys2-Cys4 、Cys3-Cys6 相配对连接。二硫键可使小
2、分子防御素紧密联结以防御蛋白酶水解，所以在富含蛋白的吞噬溶酶体环境中仍保持其特性。这也是防御素区别于其他抗微生物肽的主要因素。因其抗菌谱广且抗菌效率高，作用机制独特，不易产生抗性等特点，在抗生素抗药性日趋严重的情况下，抗菌肽极有可能成为新的抗生药物的来源。本实验基于实验室已经构建好的质粒 PUC57-mSBD-1-T，利用 PCR 技术，扩增绵羊 -防御素 1 成熟肽（mSBD-1）基因。扩增出的mSBD-1 因与 T 载体成功连接后，将其亚克隆到毕赤酵母表达载 pPIC9K 上，构建真核表达质粒 pPIC9K-mSBD-1。关键词：防御素 毕赤酵母 pPIC9K 质粒The re-const
3、ruction of pPIC9K-mSBD-1AbstractIts found that -defensins is mainly composed of mammalian skin and mucous membrane epithelial cells, composed of 38 42 amino acids. Because of their broad-spectrum of antin icrobial activity and defense against positive and negative Grams bacteria, epiphyte, protozoan
4、 and enveloped virus, in additional -defensins have distinctive antibacterial mechanism, and hardly no-endurance to drug, so the research on -defensins has become a hot spot in the world. This experimen bases on the laboratory plasmid PUC57-mSBD-1-T which has been built, using the PCR technology to
5、amplificate sheep mSBD-1 gene. With the amplificated mSBD-1 and T carrier successfully connected, put the clone to carry on pPIC9K pichia expression. So eukaryotic expression plasmid pPIC9K-mSBD-1 is built.Key Words: defensins Pichia.pastoris plasmid pPIC9K 目 录1 引言 .11.1 动物防御素的概述 .11.2 -防御素 .11.3 防御
6、素的应用前景 .21.4 毕赤酵母表达的优点 .21.5 选取质粒 pPIC9K 的优点 .31.6 研究内容 .31.7 存在的问题 .32 材料与方法 .42.1 材料 .42.2 方法 .42.2.1 绵羊 -防御素 1 成熟肽（mSBD-1）基因的克隆 .42.2.2 pPIC9K-mSBD-1 成熟肽重组质粒的构建 .73 结果 .93.1 mSBD-1 基因的克隆与测序 .93.2 pPIC9K-mSBD-1 成熟肽重组质粒的构建 .103.2.1 目的片段与表达载体的双酶切结果 .103.2.2 菌落 PCR 筛选阳性克隆结果 .113.2.3 pPIC9K-mSBD-1 测序结
7、果 .114 讨论 .125 结语 .12致 谢 .13参 考 文 献 .14内蒙古农业大学学士学位论文 11 引言1.1 动物防御素的概述在动物体内发现了一组具有抗菌作用的多肽, 称之为抗菌肽。它们参与了抵抗微生物侵害的最初宿主防御活动, 是内源免疫体系成分。目前已经从动物和植物中分离纯化出 200 种以上的多肽。抗菌肽是一种分子量少于 100 个氨基酸残基的多肽，它主要两大家族组成，防御素（defensins ）和 cathelicidins，它们广泛存在于哺乳动物的潘氏细胞和巨噬细胞内。20 世纪 80 年代中期, Ganz 研究组在研究吞噬细胞非依赖氧杀菌机制过程中，兔和人中性粒细胞胞
8、浆颗粒中发现一系列一级结构相似的小分子阳离子肽, 由于其广谱的抗微生物活性而首次以防御素一词作为这类肽的命名 1,2。动物防御素是富含精氨酸残基的阳离子多肽, 成熟肽形式其分子量3.56 kDa, 通常含有六个保守的半胱氨酸残基 3，在动物体内以一种含有 -折叠和 6 个半胱氨酸形成的 3 对二硫键框架的抗菌肽，二硫键有利于使防御素保持稳定的结构，而且还是其抗微生物活性及细胞毒效应的主要结构基础 4-5。依其 3 对二硫键形成的方式的不同，防御素可分为，-防御素、 -防御素、 -防御素 3 类。1.2 -防御素1991 年 Diamond 首次从牛的气管内发现了另外一种防御素，其分子内同样也含
9、有 6 个保守的半胱氨酸残基, 但是这 6 个保守的半胱氨酸形成的三个二硫键的连接方式则不同于 -防御素, 因此将基命名为 -防御素 6。防御素由 3842 个氨基酸残基组成， 6 个半胱氨酸残基配对形成 3 对二硫键，连接位置分别为：Cysl-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6 7，并且在 -防御素序列中部有 1 个保守的脯氨酸和 1 个甘氨酸，是 防御素所不具有的。 -防御素的信号序列和前体序列是一样的， -防御素由于具有分子质量相对较小且具有明显的半胱氨酸排列的特征使其对于详述和维持此类分子的三级结构具有重要意义。研究已证实鸡、山羊、绵羊防御素与牛的 -防御素具有显著的同源
10、性，这些宿主防御素在进化上保守。在绵羊体内要有两种 -防御素存在，SBD-1 和 SBD-2，通过 RT-PCR 检测发现 SBD-1 存在于气管和整个消化道（从舌到结肠）中，而 SBD-2 则只存在于舌和远端回肠 8。动物 -防御素是带正电荷的，具有两性的（亲水性和疏水性结构），此结构使得动物 -防御素与生物膜相互作用的方式为，阳离子域接近生物膜的带负电的磷脂凸起，而与此同时动物 -防御素的疏水部分被隐藏于由疏水链脂肪酸组成的膜的内部，从而使细胞膜表面形成孔洞，细菌内外离子浓度相同，导致细菌死亡 9。也就是，由于防御素分子带正电荷呈即阳性，能够与呈阴性带负电荷的细菌膜表面通过静电吸引而相互结
11、合，合后其分子中的疏水区与菌体膜的磷脂双分子层结构结合，后插入到细菌的细胞膜，其带正电区则与细菌胞膜上带负电的磷脂头部2 重组表达质粒 pPIC9K-mSBD-1 的构建及水分子相互作用 10-12。在细胞膜上单个或群体的防御素形成孔隙或通道，得在正常情况下在细菌体外的离子、多肽等流入到菌体内，而菌体内重要的盐类、大分子等跑到菌体外，从而使细菌的膜失去了保护作用，最终导致不可逆的菌体死亡。1.3 防御素的应用前景由于防御素特殊的抗性机理, 即主要作用于病原微生物的细胞膜, 使病原微生物不易对其产生抗性。可以避免重复使用一种抗生素可能会使致病菌产生抗药性。同时，防御素还具有十分广泛的抗性谱, 可
12、抗细菌、真菌、有囊膜病毒，甚至对支原体、衣原体、螺旋体及一些恶性细胞（如肿瘤细胞）和艾滋病病毒也有杀伤作用。因此，可将防御素作为或替代抗生素发挥其强效、广谱的抗微生物感染的作用，从而为解决细菌耐药性问题提供新的方法。并且随着基因工程技术的发展，人们把防御素基因转化进入微生物的表达系统，或直接将防御素基因导人或动物体内表达，可明显提高动物的抗病能力和传染病防治 13。1.4 毕赤酵母表达的优点酵母是低等真核生物，具有细胞生长快、易于培养、遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达时对蛋白质进行正确加工、修饰合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽
13、后加工、修饰的不足。许多无脊椎动物和植物防御素已经在巴斯德毕赤酵母中成功表达，并且人的 -防御素已在巴斯德毕赤酵母中得到成功表达 14,15。毕赤酵母（Pichia.pastoris）为甲基营养型酵母，在甲醇为主的培养基上快速生长 , 并达到很高的浓度。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点：（1）具有醇氧化酶 AOX1 基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 （2）质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 （3）菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 （4）毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免
14、受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。毕赤酵母基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子 AOX1，已高效表达了 HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素 C 片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜于扩大为工业规模 16。1.5 选取质粒 pPIC9K 的优点内蒙古农业大学学士学位论文 3毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以需要表达载体与宿主染色体发生同源重
15、组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的方式可分为：胞内表达和分泌到胞外表达两种方式 17,18。pPIC9K 属于穿梭质粒，也可以在原核表达。pPIC9K 含卡那基因（图 1）, 从遗传霉素高抗性推断该克隆所包含多拷贝目的基因数。而且用于分泌表达，分泌重组蛋白至培养基中。图 1：pPIC9K 质粒图谱1.6 研究内容基于本实验室已经构建好的质粒 PUC57-mSBD-1-T，利用 PCR 技术，扩增mSBD-1 基因。扩增出的 mSBD-1 基因与 T 载体成功连接后，将其亚克隆到毕赤酵母表达载 pPIC9K 上，构建真核表达质粒 pPIC9K-
16、mSBD-1。1.7 存在的问题-防御素是小分子肽 ，小分子肽易于受蛋白酶（多在中性 pH 条件下产）的影响，这时可以用非缓冲培养基，由于随着毕赤酵母在非缓冲培养基中的不断表达，pH 降到 3 或更低,使得许多中性 pH 蛋白酶失活，而且毕赤酵母能在低 pH 生长。另外，有报道表明在 pH 6.0 的缓冲培养基中加 1% 的 Casamino acids 可以抑制细胞外蛋白酶,使得鼠表皮生长因子的产量提高 19。还可以用确定最佳发酵时间来减少蛋白酶的水解作用,使产出时间比达到最佳。 pPIC9K 等表达载体：（1）均利用 a 因子信号肽将目的肽分泌出胞外，但常出现因信号肽酶切割效率低而导致目的
17、肽氨基端多出数个氨基酸；（2）重组子表型同外源基因整合的拷贝数和高表达特性尚不一定对应，有待建立更好的挑选高效表达阳性重组子的方案；（3）防御素在表达和纯化过程中易被降解；（4）如何避免目的肽在表达过程中不进行可能会影响其结构4 重组表达质粒 pPIC9K-mSBD-1 的构建与活性的无关修饰等。蒙古绵羊 -防御素亚克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体中，为了纯化方便，我们在 -防御素基因的 3 端加了六个 HIS 标签。由于 -防御素的成熟肽是由较少的氨基酸（38 个）残基组成的多肽，而在其 N 末端加入六个 HIS 则可能会影响到 -防御的生物学活性。因此我们同时表达的两各 -防御素（- 防御素的
18、成熟肽，在其后加六个 HIS 标签）。2 材料与方法2.1 材料（1）菌株和质粒酵母表达质粒 pPIC9K 为 Invitrogen 公司产品；pMD19-T simple 载体购自大连宝生物公司；基因工程菌 DH5 为本实验是保存。（2）工具酶和生化试剂限制性内切酶 QuickCut EcoR I、Not I、T4 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶及氨苄青霉素购自大连宝生物公司；琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自天根公司；DNA Marker DL2000（分子量为2000、1000、750、500、250、100） ；50bp DNA Marker（分子量为50、
19、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000 、1500）；溴化乙锭（EB） 、溴酚蓝购自 Sigma 公司；Tryptone 、Yeast Extract 为 Oxoid 公司产品。（3）仪器和试剂Eppendorf 5417R 低温高速离心机，德国生物公司生产；RTC-100 PCR 仪，美国 MJ 生物公司生产； DYY-型稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂生产；Tanon Gis-1000 凝胶成像分析系统，天能科技（上海）生物公司生产。 2.2 方法2.2.1 绵羊 - 防御素 1 成熟肽（ mSBD-1）基因的
20、克隆 2.2.1.1 引物的设计及合成根据 NCBI 报道的绵羊 -防御素 1（SBD-1：u75250）成熟肽序列，设计 mSBD-1 真核表达产物的引物，并在 mSBD-1 成熟肽基因两端加上合适的酶切位点 EcoR I 和 Not I 及两端的保护碱基，设计引物序列（见表 1） 。内蒙古农业大学学士学位论文 5表 1 引物序列2.2.1.2 PCR 反应PCR 反应体系：以表 1 序列为引物，实验室以构建的 PUC57-mSBD-1-T 为模板，表 2 为 PCR 反应条件进行 PCR。PCR 反应条件： 94 预变性 5 min 35 个 PCR 循环： 94 变性 30 s，51 退
21、火 30 s，72 延伸 30 s。终延伸 7 min。PCR 产物进行 2.5% 的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察。表 2 PCR 反应体系（25 L）成分 Ingredients 加样体积,Sample volume, LPremix Ex Taq 10上游引物 0.5下游引物 0.5模板 DNA 1灭菌 H2O 8总体积 total 202.2.1.3 目的片段的回收和纯化目的片段的纯化与回收按北京天根 DNA 回收试剂盒说明书进行，具体步骤如下：（1）将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中在紫外灯下切下，放入干净的离心管中加入 3 倍体积的溶胶液 PN，50 水浴放置 10 mi
22、n，其间温和的翻动离心管，引物 序列Primer Sequence( 53)5 mSBD-1 AGATTGTCCTGTCAC3 mSBD-1 TCTACAACACTTAACTGGTGG6 重组表达质粒 pPIC9K-mSBD-1 的构建确保胶块充分溶解；（2）将胶块溶解液加入一个吸附柱中，室温静置 2 min，然后 12,000 rpm 离心 1 min，弃滤液；（3）向吸附柱中加入 600 L 漂洗液 PW，12,000 rpm 离心 1 min，弃滤液；（4）重复步骤（3） ；（5）将吸附柱离心 12,000 rpm，2 min，室温放置数分钟，彻底的晾干；（6）将吸附柱安置于新的 1.5
23、 mL 的离心管上，在吸附柱膜的中央处加入 30 L 的灭菌蒸馏水，室温静置 2 min；12,000 rpm 离心 2 min，离心管中的溶液即为 DNA 回收溶液。2.2.1.4 重组克隆质粒的构建（1）目的片段与克隆载体的连接使用大连宝生物公司 pMD19-T 载体试剂盒进行目的片段与载体的连接反应。反应体系如下：质粒载体 pMD19-T 0.5 L，目的 DNA 片段 4.5 L，加入 5 L 的Solution I，充分混匀， 16 连接过夜，并将连接产物命名为 pMD19-T-mSBD-1。（2）重组克隆质粒的转化在 100 L 感受态大肠杆菌 DH5 中加 10 L 连接产物 p
24、MD19-T-mSBD-1，混匀后冰浴 30 min，42 热休克 90 s，再冰浴 2 min；加入 500 L 无抗性 LB培养基 37 摇菌 45 min；取 100 L 转化菌液涂布于含 Amp LB 培养基上 37 培养过夜。（3）重组克隆质粒的筛选及提取挑取白色单菌落接种到 1 mL 含有 Amp 的 LB 培养基中，37 200 r/min 振荡培养 8 小时后，按 1:100 量接种于含 Amp 的 5 mL LB 培养基的试管中，37 200 r/min 振荡培养过夜，然后进行重组质粒的提取，具体操作如下：将菌液转入离心管，12,000 rpm，1 min，弃上清；向留有沉淀
25、的离心管中加 500 L 溶液 P1 （含有 RNAaseA） ，振荡悬浮菌体；向离心管中加入 500 L 溶液 P2，温和的颠倒混匀使菌体充分裂解，溶液变得清亮后，加入 700 L 溶液 P3，混匀，4 ，12,000 rpm 离心 10 min，弃沉淀；将上清加入过滤柱 CS 中，12,000 rpm 离心 2 min，将离心后收集管中的溶液加入吸附柱 CP4 中，再 12,000 rpm 离心 1 min，弃滤液；向吸附柱 CP4 中加入 500 L 去蛋白液 PD， 12,000 rpm 离心 1 min，弃滤液；向吸附柱 CP4 中加入 600 L 漂洗液 PW，12,000 rpm 离心 1 min，弃滤液，再12,000 rpm 离心 2 min；将吸附柱 CP4 12,000 rpm 离心 2 min，室温干燥数分钟；
