1、湖南农业大学硕 士 学 位 论 文菜用大豆的再生与转化体系优化钟 灿 二 0 一二年四月附件 5 独创性声明与关于论文使用授权的说明独 创 性 声 明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名： 时间： 年 月 日关于论文使用授权的说明本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印
2、件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名： 时间： 年 月 日导师签名： 时间： 年 月 日第一章 引言1 毛豆概况1.1毛豆的产销现状毛豆，又叫菜用大豆、青毛豆，在日本又叫枝豆或者啤酒豆，豆科大豆属，鲜粒和干豆粒均可以作菜用 1。毛豆是鲜食未完全成熟黄豆的果实，即在豆荚鼓粒饱满，荚色、籽粒呈翠绿色时采青剥仁作为菜用的大豆，是大豆的专用型品种，同时也是深受广大消费者喜爱的高蛋白蔬菜之一 2。中国是大豆的原产地之一，最早将大豆
3、驯化并进行种植，至今有4 000多年的栽培历史，我国虽然种植大豆历史悠久，但是对大豆生产的推广研究工作开展较晚，相反在第一次世界大战欧美国家大面积种植大豆，1930年美国和加拿大通过杂交选育对大豆进行品种的改良，从而推动世界性的大豆大生产。中国是继美国、巴西、阿根廷的第四大产大豆的大国，而毛豆是中国的特产之一，在中国各大产区均有栽培，以长江中下游地区和东南沿海一带为多，其中台湾是中国毛豆的生产大省之一，其次在泰国、韩国、日本等东南亚国家也有生产。毛豆的消费市场也主要分布在亚洲国家，尤其是日本及中国东南沿海省、自治区。日本已发展成为世界上菜用大豆消费量最大的国家，每年的消费量在16 万 t 以上
4、，约 40%要从国外进口 3。毛豆营养品质和食用品质很好，且是世界公认的天然无公害蔬菜，近年来欧美市场对其需求量逐渐增多，特别是速冻毛豆在国际市场上销售量大增。1.2毛豆的品质毛豆的品质包括外观品质、营养品质和食用品质这三个方面。毛豆的外观品质只要是指其荚色、荚的大小、每荚粒数以及豆粒大小。国际上通常认为荚色翠绿、每荚至少有两粒发育良好的种子，且两粒种子必须相邻、荚长至少达到4. 5 cm、宽达到1. 3cm、厚达0. 6 cm, 鲜荚每公斤不超过340个荚，干籽粒百粒重在30 g以上，并要求豆荚含菌量少于3百万单位/g，且不应含有大肠杆菌和沙门氏菌 4。20世纪90 年代，专家一致认为毛豆的
5、食用品质应该从甜度、质地、香味和鲜味等方面综合评价，一般以甜度高的菜用大豆的口感好，其中蔗糖的含量是影响菜用大豆甜度的主要因素。籽粒中游离氨基酸的含量是继蔗糖之外影响菜用大豆口感的第二大因子。在菜用大豆籽粒的氨基酸中，谷氨酸的含量最高，而在游离氨基酸中浓度最高的是天冬门酰氨，其次是丙氨酸，谷氨酸位于第三 5。毛豆的营养品质，毛豆籽粒粗蛋白的平均含量是39.93% 6，毛豆籽粒中含有丰富的禾谷类作物所缺乏的赖氨酸，氨基酸的组成较均衡 7。对毛豆籽粒含油量的测定结果表明，菜用大豆籽粒的平均含油量为18.44%，其中含有11.07%的棕榈酸，3.22% 的硬酯酸，20.64% 的油酸，53.34%的
6、亚油酸和9.19% 的亚麻酸，其不饱和脂肪酸的含量高达84.43%，是一种高品质油。菜用大豆还含有Ca、Fe 、Mg 等多种矿务质和维生素，包括粒用大豆所缺乏的维生素C( 27mg/ 100g)和膳食纤维 8。1.3毛豆中的活性成分大豆中除了含有丰富的蛋白质、氨基酸和油脂等营养成分，还有许多生理活性成分，比如大豆皂苷、大豆异黄酮、大豆低聚糖、大豆多肽等。 神农本草经首次将大豆作为药物，并记载其药用价值，并列为“中品” 。 本草纲目记载，大豆有逐水肿、长肌肉、填骨髓、涂痈肿的作用， “久服容颜、乌发、防衰老” 。虽然大豆的活性成分较多，且对人类的生活和健康都有很大帮助。大豆皂苷就又抗肿瘤，降血糖
7、，降血脂，调节免疫等功能，但是有一定毒性 9。但是大豆异黄酮经过学者的多次均认为其安全无害，且其主要存在于豆类植物中，且是天然的植物雌性激素，在动物体内不能合成，近年来更是发现它对预防乳腺癌的功效较好，而收到国内外学者的关注。1.3.1大豆异黄酮的功能大豆异黄酮是只有在豆科植物中微量存在的多酚化合物，大豆中的异黄酮的含量为0.1% 0.3%10，是一类具有广泛营养学价值和健康保护作用的非固醇类物质 11，它主要包括染料木素、大豆苷元和黄豆黄素。大豆异黄酮带有2 个或3 个羟基和芳香环，此结构相对稳定，易于通过细胞膜，并利于和受体蛋白以及酶结合。与雌激素相似的结构特点使异黄酮能够与雌激素受体（E
8、R）结合，从而表现出雌激素活性和抗雌激素活性。大豆异黄酮的其他生物学活性还包括抗氧化活性、抑制细胞增殖和分化、抗血管生成、促进性激素结合球蛋白（SHBG ）合成等。但总的来说异黄酮的生理作用主要是由其生物活性（尤其是雌激素活性和抗雌激素活性）决定的 12。大豆异黄酮有抗癌症的作用，其对乳腺癌、胃癌、肝癌、白血病及其它一些癌细胞系的生长、增殖具有抑制作用 13。学者通过大量的癌细胞体外培养和小白鼠动物实验证明了大豆异黄酮的抗癌作用。Matsukawa 14等证实大豆异黄酮抑制人胃癌细胞HGC- 27 的增殖，使细胞停滞在G2/ M 期，其半数量大抑制效应浓度( IC50) 为20umol/L 。
9、大豆异黄酮抑制人乳腺癌可能的重要分子机制为诱导肿瘤生长因子TGF- 和TGF- 受体表达的增加，从而抑制人乳腺癌细胞BcBp- 37 的增殖，同时当大豆异黄酮的浓度 10umol/ 人时，能抑制人乳腺癌细胞MCF T 的增殖 15。Honma 16等研究表明大豆异黄酮不仅抑制人髓性白血病细胞K562 的生长 ( IC50为9.3umol/ L)，且能诱导K562 向红细胞系分化。Barnes17等实验发现用含分离大豆蛋白饲料喂养的大鼠，乳腺癌的发生数目显著低于不含大豆组，大豆异黄酮有减少肿瘤数量，延长潜伏期等作用。Sharma18等研究显示富含大豆的食品可抑制乙烯雌酚诱导的幼鼠前列腺的发育异常
10、，明显延长前列腺自发性肿瘤的潜伏期，且减少列腺癌的发生率。对结肠癌大鼠喂养含大豆异黄酮饲料，结果表明能明显抑制大肠癌的癌前病变发展，即减少畸变隐窝的发生数。此外，大豆异黄酮还能抑制人淋巴白血病细胞MOLT- 4、神经母细胞、横纹肌肉瘤细胞、尤文氏肉瘤细胞等肿瘤细胞的生长。大豆异黄酮有雌性激素和抗雌性激素的作用，在低激素水平的实验对象体内，会与雌性激素受体结合显示雌性激素作用，从而对由雌性激素衰退引起的疾病：如血脂升高、动脉硬化、更年期潮热、绝经后骨质疏松等有良好的预防和治疗效果，而在高激素水平的实验对象体内，显示抗雌性激素的作用 19。诸多学者还研究发现大豆异黄酮有降低血脂、延缓衰老、抗氧化特
11、性、预防心血管病、抗炎作用和预防老年痴呆等作用。Stintzing研究发现 大豆异黄酮的活性成分主要有 游离苷元金雀异黄素( genistein, Gen) (又称染料木黄酮)、黄豆苷元( daidzein,Den)和大豆黄素( glycitein, Gly ) 以及其衍生物共9 种化合物，而真正在体内被吸收而产生生理活性的主要成分是Gen和Den 20。1.3.2大豆异黄酮的代谢大豆异黄酮合成代谢途径由苯丙烷途径和异黄酮合成途径共同组成，主要存在于豆科植物 21。主要包括以下几个关键酶：苯丙氨酸解氨酶( PAL) 、肉桂酸羟化酶( C4H)、4- 香豆酸 -辅酶A 连接酶( 4-CL) 、查
12、耳酮合成酶( CHS) 、查耳酮异构酶( CHI) 和异黄酮合成酶( IFS) 22。其中苯丙烷类代谢途径( phenylpropanoid pathway) 是植物次生代谢过程红重要途径之一，它是木质素、花青素、芪类和黄酮类化合物等次生代谢物的共同代谢物中间体，对于植物抗性、植物品质以及人类的健康有重要的作用 23。2.毛豆高效再生研究进展豆类是重要的植物蛋白质来源的以及世界上主要的粮食和油料作物，但是由于愈伤组织难以分化、原生质体再生困难等因素，20世纪80年代以前，学者利用各种不同的大豆外植体进行豆类再生，其再生植株的发生频率和重演性都很低。直到1980 年Cheng 24等在含有105
13、0mol/L BA的改良B5 培养基上，利用无菌苗的子叶节外植体，诱导丛生芽获得了高频率的再生植株，为豆类的再生体系的建立翻开新的篇章，之后学者在此基础上通过改良培养基和利用其他不同外植体获得了较多的大豆再生植株。获得高频率的再生植株是大豆遗传转化基础，笔者从豆类的消毒、外植体选择以及培养基的配方几个关键步骤着手，综述了近年来应用较广，可以获得较好外植体的方法。2.1豆类成熟种子的消毒方法要培养出较好的豆类再生植株，首先要获得无菌苗，这就涉及到成熟大豆消毒灭菌的操作步骤。20世纪学者常用的豆类成熟种子消毒的方法的主要是70 %乙醇+0.1%HgCl2 ；70 %乙醇+ 6 %NaOCl ；或者
14、70 %乙醇+ 6 %NaOCl +0. 1 %HgCl225。2002年，刘海坤和卫志明 26发明了一种可以提高豆类成熟种子消毒效率，且能使其萌发速度更快，萌发效率更好的氯气消毒法。具体操作是取表面洁净的豆类种子，放入含有30 %NaOCl + 20 %盐酸反应生成的氯气的密闭容器中，一定时间后取出接到培养基中。首先他们取不同的豆类品种进行实验，发现氯气消毒法适宜大多数基因型的种子，平均污染率为0.9%，平均萌发率高达95.9%。然后他们对氯气消毒时间进行实验，发现消毒时间从45min到24h 消毒效果差异不大，最佳消毒时间为26h。最后他们用这种方法与上述三种方法相比较实验，发现氯气消毒能
15、降低污染率，萌发率高达98.7%，而上述三种消毒方法萌发率最高的也只有85.3% 。同时氯气消毒法能显著提高豆类萌发速度，接种后28小时就能达到80%的萌发率，而其它消毒方法的的萌发高峰期出现在接种后的50小时。笔者认为氯气消毒方法优点很多，但是其对环境和人体健康有一定影响，需要一个专用的密封的消毒空间。2.2豆类再生体系起始外植体的选择目前可用于豆类再生的起始外植体主要有幼胚、幼胚子叶、胚轴、成熟胚子叶、子叶节、初生叶和初生叶节等。程林梅等 271998年采用不同豆类品种的下胚轴、上胚轴、小真叶和幼胚作外植体进行植株再生的研究。结果表明在其供试品种中，汾豆33 号诱导植株再生率最高；诱导频率
16、依次为下胚轴 上胚轴 小真叶 幼胚；下胚轴在B5+ NAA 0. 3mg / L+ KT 1mg / L 培养基上可诱导出愈伤组织并直接分化成苗，植株再生频率为34%，最高达50%。而1999年王升吉 28等利用不同豆类品种的顶芽、胚轴、子叶节、子叶、叶片等做为外植体，进行组织培养再生研究。结果表明：在供试品种中，辽豆11号和辽豆10号的再生能力较强，诱芽率分别为39.8% 和36.0% 。对诱芽率的影响，经L 16(4)5正交实验结果为外植体品种 培养基，外植体对诱芽率影响依次为：子叶节顶芽 子叶下胚轴。张东旭 29等用胚尖再生体系与子叶节再生体系比较研究发现以胚尖为外植体的豆类再生体系具有
17、再生率高、操作简便、周期短、重复性好等优点。对于上述两种结果，笔者认为是试验品种和培养基差异等造成结果有些出入，但是近年来大多数学者培育豆类再生植株时利用子叶节和下胚轴的成功率较高，笔者经过试验，结果表明子叶节和下胚轴是获得豆类再生植株较好的外植体。2.3豆类再生体系基本培养基的选择近年来，培养基与豆类再生体系建立的关系以及激素对丛芽诱导和再生体系影响的研究较多。林树柱 30等以“合丰35”豆类品种的成熟种子为材料，研究不同浓度6-BA对诱导子叶节和茎尖出芽的影响，其中子叶节和茎尖的萌发基本培养基分别为B5培养基和1/2MS盐+B5培养基，不定芽诱导基本培养基为B5培养基，生根基本培养基为MS
18、盐 +B5培养基。豆类萌发和不定芽诱导时分别加入0.4mg L-1和1.1mgL-16-BA，每个外植体分化出的芽数最多为3.56；茎尖再生系统中，6-BA诱导茎尖不定芽形成的最佳浓度是3.5mgL -1，最佳诱导时间是2428h左右，平均每个外植体分化出的不定芽数为2.78。张东旭 29等用MS培养基作为基本培养基，探索了不同激素种类和激素浓度对胚尖诱导芽和茎伸长的影响，实验结果表明单独用浓度为0510 mgL-1 6-BA诱导5 d豆类的胚尖出芽率、植株再生率及胚尖丛生芽数等综合指标较好，植株再生率最高达84.1，当6-BA 与IBA或者GA3配合使用时反而降低了丛生芽的萌发率。而在植株茎
19、生长试验中，他们认为激素6-BA和IBA 配合使用对植株营养物质的吸收产生不良影响，从而致使部分芽枯死，所以他们建议在胚尖外植体植株茎伸长过程中不加6-BA和IBA 。他们还研究了不同激素、无机盐和蔗糖浓度对豆类胚尖生根的影响，结果表明1/2 MS+S20附加O5 mgL-1 IBA的培养基可作为多个品种的生根培养基，且再生率均在84%以上，表明该培养基是最适于诱导豆类植株生根的。曹荣等 31以为1 /2MS无机盐 + B5有机成分，添加3% 蔗糖、0.8% 琼脂，pH值为5.8，以“小粒黄”豆类子叶节为外植体，研究了萌芽天数、6-BA 及TDZ 浓度对豆类子叶节丛生芽诱导的影响。他们认为随着
20、萌发天数的增加丛生芽诱导率下降，萌发7 d的子叶节外植体对丛生芽诱导率最高，达到82.6%，而激素处理实验发现用1.5 mgL-1 6-BA 和0.2 mgL-1TDZ配比时，丛生芽诱导率最高，达到 85. 7%。此外在20世纪国内外诸多学者对不同培养基、培养基pH值和激素水平对豆类再生植株的影响做了大量研究，但是由于基因型差异，基本培养基选择的差异以及实验条件等差异，实验数据也有些差别。但是总的来看激素调节对再生植株的影响，高浓度的6-BA( 30 mgL-1)有利于丛芽的诱导，而低浓度6-BA( 1 0 mgL-1)更利于植株再生，GA3处理在促进茎生长方面能起到较好的作用，但是GA 3易
21、导致木质化，不利于根的生长，培养基的pH值调解在5.8左右时较利于植株生长。对于豆类再生体系建立的影响因素的研究，除了以上几方面以外，国内外诸多学者针对光照强弱、光照时间的长短、温度、豆类基因型、取材时间和诱导时间等进行研究，提出了利于建立豆类再生体系的培养方法。但是由于影响豆类再生体系建立的因素较多，实验数据存在差异。3.豆类遗传转化体系的建立与应用3.1豆类遗传转化体系的建立20世纪80 年代末，Hinchee等 32和McCabe等 33首先获得了转基因豆类植株，之后转基因技术成为豆类分子育种和豆类基因功能研究不可或缺的手段，转基因豆类品种选育在国内外迅速发展。2009年转基因豆类的产业
22、更是有了突破性进展，其种植面积占豆类种植总面积的77%。其种植面积以6. 92107 hm2占据全球转基因作物种植面积的52%，是目前应用面积最大的转基因作物 34。豆类的遗传转化方法主要有农杆菌介导、基因枪、电击、花粉管通道与注射、原位转化、PEG 介导等，已经获得转抗虫基因植株 35。但是, 由于豆类从转化的细胞或组织分化再生植株比较困难，实现其转化有一定难度。尽管近年来豆类的转化系统在一定程度上进行了优化，但是豆类转化仍然受基因型的限制，转化频率低， 重复性差。不同转化方法的存在不同的优缺点，王振华 36等对不同的转化方法的优缺点做了详细的综述，目前应用最为广泛的是农杆菌介导外源基因转化
23、，其中根癌农杆菌介导豆类子叶节的遗传转化系统最为常见且效果最佳。3.2豆类遗传转化体系的应用随着人们对植物油脂和植物蛋白以及天然保健食品的需求的增多，我国的豆类进口量逐年增加。而转基因技术是将具有优良性状的外源目的基因导入栽培豆类中，以获得高产、优质、抗病虫害、营养保健物质含量提高的新品种。目前转基因技术主要在豆类的抗除草剂、抗虫、改良营养品质等方面应用。3.2.1遗传转化在豆类抗病虫害和抗除草剂的应用刘德璞等 37在对大豆花叶病毒 ( SMV) 基因背景不甚清楚的情况下，经过 9年的实验用花粉管通道技术向大豆中导入抗SMV材料DNA，培育出了抗性较好的大豆品系，且它们的丰产性和品质均比原受体
24、优良，获得的抗性也可以稳定遗传，但是同一品系对SMV 的、不同毒系抗性水平稍有有差异。南相日等 38通过PEG法将B. T毒蛋白基因导入到大豆的原生质体中，并通过PCR 和Southern杂交分析，结果表明B.T 毒蛋白基因已经整合到大豆细胞基因组中，并且认为通过单细胞原生质体途径可以有效防治嵌合体的形成，提高转化频率。党尉等 39利用根癌农杆菌对大豆成熟种子的胚尖进行遗传转化，将外源双价抗虫基因cryIA（c ）和pta整合到大豆基因中，获得的5 个品系的转化率为12.31%- 18%。且他们通过实验得出当培养基pH 值为5.4，培养温度为22，用强侵染力的菌株KYRT1可以提高转化效率。崔
25、岩等 40采用花粉管通道技术将几丁质酶和BT基因导入到大豆中，并在D2代中获得稳定遗传的阳性转化大豆植株。王晓春等 41以大豆品种合丰 25的球形期体细胞胚为受体, 以CpTI 基因为目的基因, 应用基因枪法进行了遗传转化, 获得含有外源基因 CpTI 转基因大豆植株。刘海坤等 42利用根癌土壤农杆菌 EHA105/pCAMBIA2301对大豆成熟种子的胚尖外植体进行遗传转化，且对农杆菌侵染时间为20h，乙酰香酮浓度为200umol/L时，有利于获得高频率（6.4%-12.1%）的转基因大豆植株。吴颖等 43分别以大豆子叶节为材料, 利用农杆菌介导法将双价抗虫基因 B t和CpTI 转入大豆获
26、得双价抗虫转基因植株。王萍等 44,45用分别用农杆菌介导法和基因枪法将双价抗虫基因Bt和CpTI 转入固体培养的大豆胚性细胞团中。由于近年来，农杆菌介导大豆遗传转化的应用较为广泛，诸多学者对其转化体系的优化及影响因子进行了更深的研究。姬月梅等 46对农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系进行优化研究，王晓春等 47对农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化影响因子进行深入研究。在抗除草剂方面，Zhang等 48以bar 基因作选择标记基因，用除草剂草甘膦进行筛选获得转化大豆植株，但是转化系统的转化频率很低。2000 年Clemente 等 49用农杆菌介导法获得了抗草甘膦的可育的转基因大豆植株。刘昭军等
27、50利用花粉管通道介导法将含有bar 基因的p PTN140 质粒DNA 导入8 个黑龙江省大豆主栽品种(系) ，获得了抗除草剂的大豆植株，且其抗性能稳定遗传。3.2.2 遗传转化体系在提高豆类营养保健物质的应用卜云萍等 51从黄被孢中克隆 6-脂肪酸脱氢酶基因，利用农杆菌介导法将其导入豆类转化体系中，其-亚油酸（GLA）含量提高到 36.585%，转基因豆类对患有癌症小鼠的抑瘤率大大提高。雷勃钧等 52利用花粉管通道法将外源DNA导入豆类，获得了蛋白质含量高达45. 32% 的优质高蛋白品系D89-982和蛋白质+ 脂肪占 66% 的双高品系 D90-1217。Mazur 53等通过试验,
28、获得了种子油酸相对含量高达85% 比原来提高 3.4 倍，而且农艺性状优良的豆类新品系，并应用于豆类大规模商业化种植。大豆异黄酮代谢中的关键酶IFS只存在于豆科蝶型花亚科植物中，国内外学者试图通过基因克隆和限制关键酶的基因表达或者让其过表达来将豆类异黄酮导入非豆科植物或者让其代谢量增加。Jung et al.54首次从大豆中分离得到异黄酮合酶的基因ifs 后，就立即进行了基因工程研究。他们将ifs 基因转化拟南芥，野生型拟南芥缺乏合成异黄酮的代谢途径，但引入CaMV 35S( cauliflower mosaicvirus 35S gene) 启动子驱动的豆类ifs 基因后，在12个转基因拟南芥株系中的5 株内检测到genistein 合成，产量约为2 ng/mg 植物鲜重。这一开创性的工作显示外源表达的豆科植物IFS 能够利用非豆科植物宿主中的naringenin 作为底物合成异黄酮，为以基因工程手段向非豆科植物中引入异黄酮代谢途径的可行性提供了第一个实验支持。随后Yu et al.55又将豆类 ifs 基因转入烟草，发现烟草花瓣中可以合成 Gen，但是产量比豆类中低好几个数量级。郝佳等 56综合应用多基因单载体和多基因多载体方法，将豆类异黄酮代谢途径中的五个关键酶基因导入到大肠杆菌中，对异黄酮代谢
