1、学校代码 10126 学号 00611049 分 类 号 密级 本科毕业论文（设计）白刺液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白及肌动蛋白基因的克隆与基因序列分析学院、系 生命科学学院生物系 专业名称 生物科学 年 级 2006 级 学生姓名 王丽 指导教师 林晓飞 2010 年 6 月 1 日内蒙古大学本科毕业论文(设计) 白刺液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白及肌动蛋白基因的克隆与基因序列分析摘要白刺属（Nitraria L.）是蒺藜科(Zygophyllaceae )的古老小属，中国有 8 种，内蒙古有 4 种该属植物是我国内蒙古、甘肃和新疆一带荒漠植被的重要建群种之一，为耐干旱、耐盐碱、抗风蚀沙
2、埋、生长快、易繁殖的优良防风固沙先锋植物，而且具有很高的开发利用价值，因此开发其抗逆性基因资源、从分子生物学角度探讨耐盐机理具有重要的理论意义。盐胁迫是影响植物正常生长发育的最严重的非生物胁迫之一。植物盐害可分为原初盐害和次生盐害，原初盐害是指盐离子本身对植物产生的伤害，即离子胁迫导致的伤害，包括破坏质膜的选择透过性和干扰植物的各种代谢过程；次生盐害则包括由土壤盐分过多引起的渗透胁迫和由离子间的竞争引起的营养亏损。植物的耐盐机制主要包括渗透调节和降低胞内 Na+浓度。减少 Na+的吸收、外排 Na+和将 Na+区域化是保持胞内低 Na+浓度的策略，其中 Na+的外排和区域化主要由 Na+/H+
3、转运蛋白调节。液泡膜上的 Na+/H+逆向转运蛋白是将胞质内的Na+逆 Na+浓度梯度运送到液泡膜中进而将 Na+区域化集中。目前为止一些植物的液泡膜 Na+/H+逆向蛋白编码基因（ NHX）已经被克隆，而且一些研究表明NHX 基因的过量表达可显著提高植物的耐盐性。本研究以开发白刺的耐盐基因资源、揭示其耐盐分子机理为目的、利用 RT-PCR、RACE 技术及 iPCR 的方法，从小果白刺(N. sibirica Pall)中克隆了 NHX cDNA 片断，并对其进行了经过同源序列比较及进化关系分析，从而为调查该基因的表达调控模式、作用机理及利用该基因进行甜土植物的耐盐性遗传改良奠定了基础。另外
4、，本研究还克隆了小果白刺的肌动蛋白基因片断。由于肌动蛋白基因在各种不同器官上恒定表达，因而它常常被用作分子内标来研究其它基因的表达差异。小果白刺的肌动蛋白基因的克隆为今后研究 NHX 等白刺属植物的基因表达奠定基础。关键词：白刺，耐盐性，Na +/H+逆向转运蛋白，RT-PCR内蒙古大学本科毕业论文(设计) Molecular cloning and Sequence Analysis of a vacuolar Na+/H+ antiporter and Actin genes form Nitraria L.Wang LiLin XiaoFeiAbstractThe Nitraria L.
5、is a small genus of Zygophyllaceae, which primarily grows in arid and semiarid regions, saline and alkali land, desert and sand areas, and is the major constructive species of forest in western Inner Mongolia. The Nitraria plants exhibit a strong salt-resistance, and have important economical- and e
6、cological-value. Therefore, the research on molecular mechanism of stress tolerance is very necessary in Nitraria.Salt stress is one of abiotic factor that cause serious limitation on plant growth and development. Plant salt stress include primary salt and secondry salt, primary salt refers to the i
7、njury on plant by ions, including the damage of selective penetrated property of plasma membrane and interference on plant metabolism; secondary salt refers to the osmotic stress by excessive soil salinity and the nutrient loss by ion competition. Since the first vacuolar Na+/H+ antiporter gene, ref
8、erred to as NHX, was cloned from Arabidopsis, more than 500 of NHX orthologs were isolated. Previous research indicated that over-expression of NHX gene can enhance salt-tolerance ability of plants.In the study, we isolated a cDNA fragment of NHX homology from N. sibirica Pall using RT-PCR, RACE and
9、 iPCR, and analyzed its gene structure and phylogenetic relationship. The results will prove an important experimental basis for analyzing the expression pattern and molecular mechanism of NHX gene, and for improving salt-resistant ability of glycophytes through genetic transformation with NHX genes
10、 of Nitraria L. On the other hand, we isolated a cDNA fragment of actin gene from N. sibirica Pall. The expression of actin genes are stable in each organs, therefore, it was used as an internal standard for analyzing gene expression. The experimental result could prove useful for gene-expression an
11、alysis of Nitraria plants.内蒙古大学本科毕业论文(设计) Keyword : Nitraria L.，salt-tolerance ，Na +/H+ antiporter，RT-PCR 目录内蒙古大学本科毕业论文(设计) 1 绪论 .71.1 盐胁迫对植物的影响及植物耐盐机制 .71.1.1 盐胁迫对植物的伤害 .71.1.2 植物的耐盐机制 .81.2 液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白 （NHX）研究进展 .81.2.1 液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白的分子特征 .81.2.2 液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性的表现 .91.2.3 液泡膜 Na+/H
12、+逆向转运蛋白的功能研究 .101.3 本研究的目的及意义 .122 材料与方法 .142.1 材料 .142.1.1 植物材料的培养 .142.1.2 实验试剂及配制 .142.1.3 实验使用试剂盒 .152.1.4 实验用引物 .162.1.5 载体及菌株 .162.1.6 主要仪器设备及其他 .162.2 实验方法 .172.2.1 兼并引物设计 .172.2.2 白刺总 RNA 的提取及鉴定 .182.2.3 cDNA 第一链的合成 .192.2.4 白刺 Na+/H+逆向转运蛋白基因 cDNA 片段的克隆 .202.2.5 白刺肌动蛋白基因片段的克隆 .202.2.6 大肠杆菌 D
13、H5 超级感受态细胞的制备（ TB 法） .212.2.7 PCR 产物的凝胶回收及 TA 克隆的与转化 .212.2.8 克隆基因片段序列的测定 .232.2.9 白刺 Na+/H+逆向转运蛋白 cDNA 3末端的快速克隆（RACE） .232.2.10 白刺液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 5末端的获得 .252.2.11 Na+/H+逆向转运蛋白序列分析 .283 结果与讨论 .293.1 实验结果 .293.1.1 RNA 的变性琼脂糖凝胶检测结果 .293.1.2 PCR 产物鉴定 .293.1.3 白刺 Na+/H+逆向转运蛋白 3末端 cDNA 的克隆 .303.1.4 菌落
14、 PCR 鉴定含重组质粒菌落 .303.1.5 白刺 Na+/H+转运蛋白基因 5末端的获得 .313.1.6 序列的 blast 比对结果 .313.1.7 基因片段的 Na+/H+逆向转运蛋白基因序列分析及系统树构建 .333.2 讨论分析 .333.2.1 RNA 的变性琼脂糖凝胶电泳 .333.3.2 Na+/H+逆向转运蛋白基因的分离 .343.2.3 肌动蛋白基因的内参作用 .344 致谢 .365 参考文献 .37内蒙古大学本科毕业论文(设计) 6 附录 .391 绪论1.1 盐胁迫对植物的影响及植物耐盐机制干旱半干旱地区，水分蒸发把地下盐分带到土壤表层，造成土壤表层盐分内蒙古大
15、学本科毕业论文(设计) 过多；海滨地区海水倒流或咸水灌溉等因素，土壤表层会积累较多盐分。自然界中造成盐胁迫的盐分主要是 NaCl、NaHCO 3、Na 2CO3、 Na2SO4，通常这些盐同时存在，称为盐碱土。全世界大约有 20%的可耕土地及一半以上的水浇田受盐渍化影响，并且这种影响日益加剧。我国盐渍化土壤主要分布于北方和沿海地区，盐渍化使土壤水势下降。严重阻碍植物生长发育，已成为盐碱地区限制作物产量的主要因素 【1】 。1.1.1 盐胁迫对植物的伤害 植物盐害可分为原初盐害和次生盐害 【2】 ，原初盐害是指盐离子本身对植物产生的伤害，即离子胁迫导致的伤害，包括破坏质膜的选择透过性和干扰植物的
16、各种代谢过程；次生盐害则包括由土壤盐分过多引起的渗透胁迫和由离子间的竞争引起的营养亏损。1.1.2 植物的耐盐机制 不同植物对盐胁迫的适应方式不同，或者通过减少盐分在体内的积累逃避盐害，或者通过自身生理或代谢过程来适应或忍受细胞内的高盐环境。具体途径可分为：一是减少 Na+的吸收及增加 Na+的外排，植物细胞在确保其他离子吸收的条件下选择性的排斥 Na+，不让其通过质膜，而高等植物的排 Na+机制主要与质膜 Na+/H+逆向转运体（SOS1 ）有关，质膜 H+-ATPase 的主要功能是驱动质子排出质膜，建立跨膜 pH 梯度和电势差，即质子驱动力，提内蒙古大学本科毕业论文(设计) 供能量驱动膜
17、上 Na+/H+逆向转运体，使质子顺电化学梯度进入细胞，同时 Na+逆化学势排出细胞。二是盐分的区隔化，主要由液泡膜上质子泵、Na +/H+逆向转运体（NHX）和离子通道所调控。液泡膜上存在两类质子泵，分别为液泡膜H+-ATPase 和 H+-PPase，他们分别通过水解 ATP 和焦磷酸（PPi）产生能量将H+进行定向运输，在液泡膜两侧形成质子梯度 【3】 ，提供能量驱动液泡膜上Na+/H+逆向转运体，从而使 Na+进行跨膜运输，被动进入液泡。三是渗透调节作用，一些盐生植物依靠从外界吸收和积累无机盐离子，进行渗透调节防止盐害，或者在细胞中合成大量不同有机物以降低细胞的渗透势。四是合成保护蛋白
18、，又称渗透胁迫蛋白 【4】 。1.2 液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白（NHX）研究进展1.2.1 液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白的分子特征 植物胞内 NHX 家族分为两类，分别用符号 I 和 II 表示。所有的 NHX I 类成员都定位于液泡膜上，并在胞内形成一个独立的转运子分支。相对而言，II 类的成员存在于植物内膜囊泡上，同时也包括定位于动物和细菌中多种内体上的同源蛋白。在已知基因组全序列的拟南芥和水稻中，NHX 基因家族的序列大小几乎相同。拟南芥有 6 个 NHX 基因（AtNHX） ，水稻有 5 个 NHX 基因（OsNHX） 。它们的分配方式相似，AtNHX1-4和 OsNHX1
19、-4 构成 I 类,AtNHX5-6 和 OsNHX5 构成 II 类。拟南芥和水稻的 I 类组成员显示出 56.0-87.5%的相似性，而 II 类成员的相似性为 78.7%，但是与 I 类的相似性只有 21%-23%【5】 。Zorb 等 【6】 克隆了玉米(Zea mays L.)NHX 家族的六个成员 ZmNHX16，其中，ZmNHX1 ， 2， 6 属于一个亚家族，与拟南芥AtNHX1，2 同源性高，而 ZmNHX3， 4， 5 属于另一个亚家族，与拟南芥AtNHX46 同源性高。这六个成员具有器官和盐处理特异性的表达模式。分析植物 Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列的亲水性图谱包括
20、 N 末端的跨膜区域和C 末端的胞质区域。前者对氨氯吡嗪脒（amiloride）及其衍生物敏感，是负责转运的区域，由 9-12 个跨膜结构域组成。后者大约由 300 个碱基组成，结构域内含有多个蛋白激酶作用位点，能够与钙调素（calmodulin）结合，参与多种信号反应，是调节活性的区域 【7】 。Yamaguchi 等 【8】 分析了 AtNHX1 的膜拓扑学结构，他们发现 AtNHX1 蛋白的整个结构不同于人的 Na+/H+交换蛋白 NHE1 和任何已知的其他 Na+/H+逆向转运蛋白。 AtNHX1 由 9 个跨膜区域和 1 个亲水的 C内蒙古大学本科毕业论文(设计) 末端结构域组成，其
21、中 3 个推测的疏水跨膜区 TM3、TM5、TM6 看上去与膜相连，实际上并没有跨过液泡膜。他们的结果还表明，AtNHX1 的 N 末端朝向胞质，但几乎整个 C 末端都位于液泡腔中。与其蛋白家族的其他基因相比，AtNHX1 N 末端很保守，对于 Na+/H+逆向转运蛋白的活性非常重要。AtNHX1的 TM3 区具有一个推测的氨氯吡嗪脒结合序列(FFIYLLPPI) ，这段序列在其他植物 NHX 以及哺乳动物 NHE 中均高度保守，氨氯吡嗪脒与真核生物 Na+/H+逆向转运蛋白结合后能抑制其转运活性。AtNHX1 的 TM5 和 TM6 与人 NHE 中高度保守的 TM6 和 TM7 相对应，T
22、M6 和 TM7 对 NHE1 的转运活性很重要，但 AtNHX1 的 TM5 和 TM6 区不跨膜，所以很难说它们对于 AtNHX1 的转运活性起重要作用。另外，AtNHX1 的 TM3 与 TM5、TM6 可能分别构成了胞质和液泡中结合离子的结构，它们的方向决定离子运动的方向。Rajagopal 等 【9】 对珍珠栗 Pennisetum glaucum 液泡膜 Na+/H+转运蛋白 PgNHX1 与AtNHX1、OsNHX1 做了比较，后者含有 9 个跨膜结构域，而 PgNHX1 为 5 个跨膜结构域包括一个钙素结合区域，调控 PgNHX1 的活性，TM3、TM4 区与AtNHX1、Os
23、NHX1 的保守性较高。Yamaguchi 等 【10】 进一步分析了位于液泡腔内 C 末端， AtCaM15(类似钙调素的蛋白)位于 C 末端，依赖于 Ca2+和 pH 值，调控 Na+/H+转运蛋白底物的选择性，以及液泡中的 pH 值调控 Na+/H+转运蛋白与阳离子亲和性。AtNHX1 C 末端的缺失使 Na+/H+选择比率增加一倍，证实C 末端的调节功能。1.2.2 液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性的表现 NHX1 基因在植物耐盐性的作用主要表现在以下三方面：一是利用液泡膜 H+-ATPase 和液泡膜 H+-PPiase 产生的跨膜质子梯度将胞质中的 Na+逆浓度梯度运入
24、液泡中 【5】 ，这样降低了胞质内的 Na+含量，维持胞质正常的 K+/Na+比值 ,而且可以有效利用储存在液泡中的 Na+作为渗透剂,降低 Na+对植物细胞的毒害作用 【11】 。即使在胞质内Na+浓度很低的情况下，Na + 也可主动泵进液泡中，Cl -则被动的由阴离子通道进入液泡平衡膜内外的电荷差别 【12】 。 ；二是 Na+/H+逆向转运蛋白的 C 末端对其转运活性和离子选择性的调控，植物液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白的 C 末端比质膜Na+/H+逆向转运蛋白的 C 末端短得多，仅有 100 多个氨基酸。 AtNHX1 的 N 末端朝向胞质而整个 C 末端亲水区域都在液泡内，Yama
25、guchi 等 【6】 的转运研究认内蒙古大学本科毕业论文(设计) 为 AtNHX1 的 C 端调节转运蛋白阳离子的运输，C 末端可能是糖基化或其它蛋白修饰的位点。利用酵母异源表达系统进行末端缺失实验中，N 末端缺失 17 个氨基酸引起 Na+/H+转运活性轻微降低和 K+/H+转运活性的少量增加。亲水性 C末端的 82 个氨基酸缺失使 Na+/H+转运活性大大增加，而这种缺失导致 K+和 H+的运输速率相对降低，Na +和 K+的运输比率也是未修饰的两倍。说明 AtNHX1的 C 末端对 Na+/H+逆向转运蛋白活性及底物选择性具有调控作用。另外，Yamaguchi 等 【8】 异源表达酵母
26、细胞的实验表明 AtCaM15(类似钙调素的蛋白) 定位于液泡腔内的 AtNHX1 C 末端，依赖于 Ca2+和 pH 值，随 pH 值的升高降低与 AtNHX1 的连接，同时改变转运体对 Na+/H+的选择性。关于 C 末端的作用以及调控机制，还有待于人们更进一步的研究。三是 NHX1 基因在 NaCl 存在下诱导表达，同时 NaCl、KCl、ABA 正调控 AtNHX1 的转录水平，在盐胁迫和 ABA调控 AtNHX1 的表达实验 【13】 中，NaCl、KCl、ABA 可以正调控 AtNHX1 的转录水平。对转基因拟南芥 AtNHX1 启动子-GUS 的分析结果启动子区包含推测的 ABA
27、 反应元件(ABRE)，位于起始密码的 736-728 之间，ABRE 元件存在于不同物种对 ABA 应答的基因中。由于 AtNHX1 启动子的活性可被 NaCl、KCl 和ABA 上调,表明 AtNHX1 的表达受盐和 ABA 的上调是在转录水平上的调控。NaCl 对 AtNHX1 的上调程度在 abi1-1(ABA 不敏感突变体)、aba2-1 和 aba3-1(ABA 缺乏突变体)中被减少，但在突变体 abi2-1、sos1(质膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 SOS1 突变体)、sos2(蛋白激酶基因 SOS2 突变体)和 sos3(钙结合蛋白基因SOS3 突变体)并无类似情况发生。A
28、BA 诱导的 AtNHX1 的表达同样在 abi1-1 中被减少，但 abi2-1 中没有。这些结果表明，盐胁迫下在转录水平上 AtNHX1 表达的增强，部分地依赖于 ABA 的生物合成和 ABA 通过 ABI1 发出的信号。ABI1 可以调控 NHX1 等基因的表达，ABI2 则可以通过抑制 SOS2 的激酶活性或SOS2 底物的活性来负调控离子均衡。1.2.3 液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白的功能研究 目前在这方面的研究主要从以下几方面展开：一是 NHX1 基因表达可部分恢复酵母 nhx1 突变表型，Xia 等 【14】利用 RT-PCR 从甜菜 Beta vulgaris Linn.中克隆出与拟南芥 NHX1 同源的 BvNHX1基因。将 Bvulgaris Na+/H+转运蛋白基因 BvHNHX1 在对盐敏感的酵母 nhx1 突变体 ena1-4nhx1 菌株中异源表达，结果证实 BVNHX1 至少与酵母 NHX1 基因功能部分等价。Hamada 等 【15】 从盐生植物滨藜中克隆出 Na+/H+转运蛋白，命名
