1、学校代码 10699分 类 号 R318密 级学 号 066180772题目 基于广谱性单克隆抗体的有机磷农药多残留免疫检测方法的研究作者 苏婧学 科 、 专 业 生物医学工程指 导 教 师 薛小平申请学位日期 2009 年 3 月硕士学位论文基于广谱性单克隆抗体的有机磷农药多残留免疫检测方法的研究申 请 人： 苏 婧学 号： 066180772所在学院： 生命科学院学科专业： 生物医学工程指导教师： 薛小平辅导教师： 杨 慧申请学位日期： 2009 年 3 月A Dissertation Submitted to Northwestern Polytechnical University f
2、or the Master DegreeDevelopment of Immunoassays for Multiple Residues of Organophosforus Pesticides using Monoclonal AntibodiesAuthor: Su JingSpecialty:Biomedical Engineering Supervisor:Prof. Xue XiaopingTutor: Dr.Yang HuiFaculty of Life SciencesNorthwestern Polytechnical UniversityXian Shaanxi, P.
3、R. ChinaMarch, 2009西北工业大学硕士学位论文 摘要I摘 要近几十年来，有机磷农药(Organophosphorus Pesticides, OPs)在农业及畜牧业中得到广泛应用。与此同时，由农药残留引起的食品安全问题也越来越受到人们的关注。 仪器分析法是对有机磷农药残留检测中最经典、最常用的技术，主要采用色谱方法，包括：薄层色谱法（TLC） 、气相色谱法（GC） 、高效液相色谱法（HPLC） 、气相色谱质谱联用（GCMS ）和高效液相色谱质谱联用（HPLCMS）等技术。这些传统的方法具有灵敏可靠的优点，但是，它们也存在一些明显的不足：成本高、需要昂贵的仪器设备和专业的分析人员
4、，样品准备程序复杂，并且不利于现场操作。因此，迫切地需要建立一种简单、快速、灵敏、价廉，并能够适用在实验室和现场进行大批量的检测和筛选试验的检测技术。免疫检测法是基于抗原抗体特异性识别和结合反应的是一类新的快速、敏感。简便的检测方法，能够满足以上要求，从而日益受到人们的重视。传统的农药残留免疫检测技术只针对某一种特定的农药残留进行分析。本文基于实际应用中常采取多种农药混合搭配使用的特点，以与原药母体结构密切相关的类似物作为通用性半抗原，将通用性半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA ）和卵清蛋白（OVA ）偶联，分别合成免疫原和检测抗原，免疫小鼠，制备、筛选出一种能识别一类或几类具有相似结构的有
5、机磷杀虫剂的广谱性鼠源性单克隆抗体（mAb） ，以达到对多农药残留同时检测的目的。本研究中所制备的抗有机磷组特异性单克隆抗体的效价为 1106（间接ELISA 实验） ，参考工作稀释浓度为 1:16000。利用间接竞争性 ELISA 法对几种有机磷农药：乙基毒死蜱、甲基对硫磷、辛硫磷和三唑磷的标准品进行检测，绘制出竞争抑制曲线。结果表明：由于农药化学结构的不同，检测灵敏度有一定的差别；其中对乙基毒死蜱检测灵敏度较高，最低检测限（LOD）为 4 ng/mL，对甲基对硫磷的 LOD 为 63 ng/mL。而辛硫磷和三唑磷的化学结构与半抗原差别较大，检测敏感度低、一致性差。胶体金免疫层析技术（Gol
6、d immunochromatography assay, GICA）是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。该方法无需精密检测仪器以及专业的实验操作人员，可以在很短的时间内完成现场检测。它的原理是：以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体（抗原或抗体）发生高特异性、高亲和性的免疫结合反应，层析过程中形成的免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带） ，运用摘要 西北工业大学硕士学位论文II可目测的标记物(胶体金) 能够直观的观察检测结果(显色条带)，也可
7、以借助专用检测设备判读检测结果。本文在已制备出抗一类有机磷农药的组特异性单克隆抗体的基础上，又通过鞣酸柠檬酸三钠还原法制备出直径 16.080.64nm、质地均一的胶体金，并且以此标记单克隆抗体，组装胶体金免疫层析检测板，从而快速地对上述有机磷农药进行检测。结果表明：该检测板对乙基毒死蜱具有较好的检测灵敏度，LOD 为：4 g/mL，检测时间为 5 分钟。最后，利用酶免疫检测法和胶体金免疫层析检测板对添加乙基毒死蜱的蔬菜、水果、土壤、自来水等模拟样本中进行实验检测，以评价不同样品基质是否对这两种检测方法存在干扰以及干扰程度。结果表明：样品基质对酶免疫检测法的检测灵敏度有一定的影响，乙基毒死蜱标
8、准品回收率在 70%-90%之间；而对胶体金免疫层析检测板的检测灵敏度基本无干扰，最低检测限没有改变。关键词：有机磷农药、多种残留检测、单克隆抗体、胶体金免疫层析西北工业大学硕士学位论文 AbstractIIIAbstractIn recent decades, Organophosphorus pesticides (OPs) are widely used in agricultural and domestic settings. For analysis of OPs, the traditional methods, thin-layer chromatography (TLC),
9、high performance liquid chromatography (HPLC) and Gas chromatography (GC), with high sensitivity and specificity are laborious and expensive. Therefore, there is growing demand for more rapid and economical methods for determining pesticide residues. Immunoassays that can meet such demands have rece
10、ntly emerged as a fast, sensitive, and cost-effective alternative to the traditional methods.Although most of the immunochemical assays developed for the determination of pesticides are aimed at detecting individual pesticides, the mix of a variety of pesticides is usually applied in field. This pap
11、er selected a generic Hapten that has a O,O-Diethyl thiophosphate group common in OPs and conjugated the Hapten to BSA and OVA respectively to generate an immunogen and a coating antigen. An immunoassay for class-specific determination of OPs using monoclonal antibodies (mAb) against the Hapten was
12、developed.The titer value of the mAb was 1106 by indirect enzyme linked immunosorbant assays (ELISA), while the optima dilution for ELISA was 1:16000. The mAb showed desirable properties for use in determination by indirect competitive ELISA. The limit of detecting (LOD) value of Chlorpyriphos-ethyl
13、 was 0.004g/mL. The LOD value for parathion-methyl was 0.063g/mL.Gold immunochromatography assay (GICA) is based on the distribution of molecules in a biphasic system. For test, an aqueous sample and the labeled antibody migrates by capillarity to the test zone. The binding of labeled antibody to im
14、mobilized antigen on solid phase leads to the accumulation of colloidal gold and then a red color can be observed rapidly by naked eyes. There are no need for fussy operations as incubation, washing and enzymatic reactions which distinctly shorten the detection time. Especially, the results can be r
15、ead directly by naked eyes, which are more suitable for assays on-site.This paper prepared uniform colloidal gold particles with a diameter of 16.080.64nm by the Tannin-sodium citrate reduction method, labeled mAbs with this nano-gold and then constructed immunochromatographic (IC) testing boards. T
16、he IC Abstract 西北工业大学硕士学位论文IVtesting board was validated to complete a detection assay within 5 minutes, and the LOD value of Chlorpyriphos-ethyl was 4g/mL.To evaluate the interferences from components in variously environmental matrix, samples of fruits, vegetables, tap water and soil spiked with C
17、hlorpyriphos-ethyl were test. The results showed that the pesticide could be detected and no interference was observed in the real samples.Key words: organophosphorus pesticides, multi-residue detecting, monoclonal antibody, gold immunochromatography assay西北工业大学硕士学位论文 目录I目 录第一章 绪 论 .11.1 有机磷农药使用现状及危
18、害 .11.2 有机磷农药残留检测方法及快速检测技术的研究现状 .21.2.1 色谱法 .21.2.2 快速检测法 .31.3 农药残留酶免疫分析技术的国内外研究现状 .51.4 胶体金免疫层析技术的研究进展 .6第二章 抗原合成与单克隆抗体的制备 .92.1 材料与方法 .102.1.1 主要试剂与仪器 .102.1.2 实验动物 .112.1.3 溶液系统 .112.2 实验方法 .122.2.1 半抗原合成 .122.2.2 人工免疫原及检测抗原的制备 .132.2.3 人工免疫原及检测抗原的鉴定 .142.2.4 杂交瘤细胞株及单克隆抗体的制备 .152.2.5 单克隆抗体鉴定 .15
19、2.3 实验结果与分析 .162.3.1 半抗原合成 .162.3.2 人工免疫原及检测抗原的制备及鉴定 .172.3.3 杂交瘤细胞株及单克隆抗体的制备 .202.3.4 单克隆抗体的纯化与鉴定 .212.4 讨论 .23第三章 有机磷农药多残留检测研究竞争性酶联免疫吸附实验 .273.1 材料 .283.2 实验方法 .283.2.1 抗体、抗原最佳工作浓度选择 .283.2.2 间接竞争 ELISA 检测方法标准曲线的建立 .28目录 西北工业大学硕士学位论文II3.2.3 样品添加回收率测定 .293.3 实验结果与分析 .293.3.1 抗体、检测抗原最佳工作浓度 .293.3.2
20、间接竞争 ELISA 检测方法标准曲线的建立 .303.3.3 样品添加回收率 .313.4 讨论 .32第四章 有机磷农药多残留检测研究（2）胶体金标记侧向流免疫检测技术 .354.1 材料 .364.2 实验方法 .364.2.1 胶体金制备 .364.2.2 胶体金标记单克隆抗体 .364.2.3 胶体金单克隆抗体结合物的免疫反应性鉴定 .374.2.4 紫外可见光谱扫描 .374.2.5 荧光光谱分析 .374.2.6 电镜鉴定 .374.2.7 DLS 分析 .384.2.8 侧向层流胶体金免疫试纸条的制备 .384.2.9 胶体金试纸条对毒死蜱标准液的反应 .384.3 实验结果与讨论 .394.3.1 胶体金单克隆抗体结合物的免疫性 .394.3.2 紫外可见光谱扫描结果 .404.3.3 荧光光谱分析 .404.3.4 电镜鉴定 .414.3.5 DLS 分析 .424.3.6 胶体金试纸条对毒死蜱标准液的反应 .434.4 讨论 .44第五章 小 结 .47参考文献 .49发表论文和参加科研情况说明 .54致谢 .55
