1、多样性的进化和跳增 Polo 样激酶 -1 抑制剂Polo 样激酶（Plk1），是丝氨酸/苏氨酸酶中的一种，它是抗癌药物的发展历程中很具吸引力的样品，因为它涉及到细胞周期进程的规定及胞质分裂。这个激酶为开发 Plk1 抑制剂提供了两种途径：n 端催化域（NCD）和 polo-box 域（PBD）。对于这两个域，一些天然产物被确定为 Plk1 抑制剂，一些则被模拟 ATP 和磷酸化肽段开发成 P1k1 抑制剂，天然产物分别为NCD 和 PBD 所约束。本文不仅评论 Plk1 抑制剂的这两个途径的发展，还讨论了以多样性进化及药物开发的跳增过程中使用 Plk1 抑制剂为例，以及它们是如何影响药物设计
2、和药效团模型的。1.介绍化学的空间是巨大的，据估计可能存在的药物如分子的数量就超过 1060,这与目前已知的107形成了鲜明的对比。对于药物的发现，部署这么一个多样性的化学库是非常重要的。虽然天然产物，与特定分子的化合物和生物体产生不同的结构特点，可能只占化学空间里的很小一部分，通过自然选择，他们拥有一个独特的、巨大的化学多样性。个体天然产物及其结构成员有多个最佳的生物活性，因此最有可能绑定多个目标，然后影响它们的功能。因此，天然产物是目前最富有的新颖的化合物来源，在药物发现中发挥了重要作用，尤其是抗生素和癌症治疗领域的发展。很多市场上的药物是原始的天然产物或者是源于天然产物经过一定的化学修饰
3、，即天然产物已为获批药物和多年的多种疾病的候选药物提供的众多的支架。在这里，我们指的是小/中等化学修饰的多样性演变。可能是本案最知名的例子是衍生和结构简化类似物吗啡制剂，这是从鸦片中分离的一种强效镇痛剂，用来开发更多的镇痛化合物。另一个例子是阿托伐他汀，他汀类药物，是销售总额达到 125000000000 美元的医药史上最畅销的药物。这种化合物由美伐他汀得到启发和发展，从桔青霉分离的胆固醇降低剂。更多的他汀类药物通过多样性进化得到发展。在这种情况下，基于共同的分子对生物大分子，其药效团模型就可以被开发。然而，在少数情况下，成熟的配位体结构与其原来的模版并不相同，很难开发基于它们之间的相似性药效
4、。在极端的情况下，虽然他们结合到相同的结合位点，但和一些配位体的尺寸完全不同。这是不可能概括这些配位体的共同特征的，或者说它违背了药效团的概念。我们称之为多样性的跳变。在药物发现的真实世界里，通过从类药物空间多样性的演变和跳增，药物学家追求的是将结构不同的配体，然后经过选择进一步发展成最好的。本文将重点对多样性的进化和多样性从天然产物如 ATP 和使用 Plk1 为例，讨论它们如何影响药物设计、药效团模型。2.Plk1 抑制剂的进展2.1 蛋白激酶和基于 ATP 抑制剂多样性跳增的设计蛋白激酶，拥有超过 500 个成员的的最大的蛋白家族之一，通过添加丝氨酸和苏氨酸的磷酸基团或酪氨酸残基来修饰其
5、他蛋白质。磷酸化是许多疾病的一个必要步骤，包括癌症，炎症，糖尿病。因此，药物学家已经对蛋白激酶产生了极大的兴趣，已经作为治疗目标的药物靶点的第二大组。自 2001 年起许多激酶抑制剂已经被批准用于治疗癌症和炎症。所有的激酶在 ATP 反跳的时候都有一个催化结合域的结合。ATP 是一种核苷酸磷酸在细胞里作为辅酶。设计激酶抑制剂的策略是模仿 ATP 来适合催化和抑制目标。然而，ATP 和成熟的抑制剂的结构是截然不同的。ATP 是在生理条件下与许多负电荷的极性分子。然而大多数成熟的蛋白激酶抑制剂是中性的；它们中的一些甚至可以在 PH 值为 7.4 的环境带正点。在这种情况下，它是一种多样性跳增将 A
6、TP 合成为激酶抑制剂。激酶催化裂，由不同的结合子的域，是一个 N-末端的叶和叶之间形成较大的 C-末端。ATP结合位点，类似一个狭小的疏通管道，显示了除了活化环和 P 环外的有限的运动。它关注的是由于不同的激酶的 ATP 结合裂的两序列和形状相似性程度高，很难发展所需的 ATP 竞争性抑制剂的选择性。然而，一些高选择性的 ATP 竞争性激酶抑制剂已经被开发了。激酶的铰链区，大部分的 ATP 竞争性激酶抑制剂形成两个，甚至三个氢键与蛋白质，包括一个氢键受体位于一个或两个氢键供体两侧。选择性是由看门人的侧链的尺寸/体积定义的部分。2.2 Plk1 作为癌症治疗的目标Plk1 基因是高度保守的亚家
7、族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，命名为 Polo 样激酶，其中包括五名成员,Plk1-5 位于哺乳动物细胞中，参与细胞的生长，以及在不同物种中的有丝分裂检查点调控。这五个成员，Plk1 是最广泛的研究和表征，Plk1 在 M 期的多个阶段起关键作用，并且作为细胞增殖的一个结果。与正常组织相比，Plk1 在广泛的人类癌症中过度表达，包括乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，甲状腺乳头状癌，卵巢癌，等。Plk1 也已被确定为一个阴性患者的预后标志物肿瘤。结合并抑制 Plk1 可导致有丝分裂停止，中断细胞分裂，凋亡敏感的肿瘤细胞群。因此，Plk1 是一个非常有吸引力的目标在制定具体的抑
8、制剂来选择性地治疗癌症的同时避免对正常组织的毒性。在过去的几年中，许多 PLK1 抑制剂拥有优秀的临床评价。关于 PLK1 抑制剂的一些评论已经发布，包括一些著名的 PLK1 抑制剂的临床前和临床数据。然而这篇综述，以讨论多样性演化和使用 PLK1 抑制剂作为例子。同样作为 Plks 家族的其他三名成员，Plk1 由两个结构域组成：N-末端的催化结构域（NCD），这是负责 ATP 的结合和酶的活化，和 C-末端的催化，但功能必不可少。Polo-box 结构域（PBD），其功能是作为一个磷酸肽结合基序，被认为在靶向酶的催化活性的特定的亚细胞结构中发挥了至关重要的作用。两个领域内 Plk1 可望作
9、为抗癌药物的发展目标。因此，可以根据其作用方式区分不同的 PLK1 抑制剂：ATP 竞争性抑制剂（PLK1 NCD 抑制剂）和基板的竞争性抑制剂（Plk1 的 PBD 抑制剂）。然而，PLK1 抑制剂的作用机制尚未完全建立。表 1 列出了目前在临床前和临床研究 PLK1 抑制剂。2.3 Plk1 抑制剂与 NCD 的结合Plk1 的 ATP 结合裂深腔表现为激酶抑制剂发展的经典目标。然而，由于 ATP 结合裂缝在结构上高度保守，只有少数的小分子抑制剂能结合 PLK1 的 NCD。一些著名的例子如图 3 所示。其中，BI2536 和 PHA680626 不是 Plk1 的选择性：它们可以与 Pl
10、k1、Plk2 和 Plk3 相互作用；它们中的一些如 BI 6727, GSK 461364, GW843682X, NMS-P937 Ro5203280 和 TAK-960 等与Plk1 则更具体化。到目前为止，许多携带不同抑制剂的 Plk1 NCD 和 PBD 的 X 射线结构晶体已经可以分解并存放在蛋白质数据库，它为观察配体如何与目标相互作用提供了良好的途径。然而，一些未经发布的人类的 Plk1 与 ATP 无法结合 X 射线结构晶体，但是斑马鱼的 Plk1 与 ADP 是可以结合的。给出 hplk1 与 zplk1 的高级序列，显示 zplk1 可能有相同的组织和功能如 hplk1。
11、因此讨论得出斑马鱼的 Plk1 可以替代人类的 Plk1。zPlk1-ADP 的复杂性表明 ADP 的活性部位的铰链区可以通过双氢键与 Glu 117 和半胱氨酸相互作用。一个氢键之间形成 3-OH 的核糖环和 Leu 45，赖氨酸 68 和甘氨酸 49 之间的两个氢键磷酸基团可观察到其形成。磷酸腺嘌呤在疏水口袋包括苯丙氨酸 169，胱氨酸 53，丙氨酸66 和亮氨酸 66 都有残留。渥曼青霉素的真菌，绳状青霉类固醇代谢物，邬氏黄丝曲霉，是 PLK1 和 PI3 激酶的一种共价抑制剂。它与 zPlk1 的复杂都是有效的。该化合物具有与 ATP 完全不同的化学结构，我们可以说是这两种化合物间的一
12、种多样性跳增。渥曼青霉素结合不同的 ATP 主要是通过共价键连接来催化赖氨酸 68，除了氢键与相同的残留结合。一个氢键与活性位点的铰链区结合可以维持渥曼青霉素和胱氨酸 119 的五元环的羰基。渥曼青霉素的疏水性稠环占据疏水口，ATP 的腺嘌呤也占据着。多种数据显示，ATP 和渥曼青霉素与 Plk1 的 NCD 结合在相同位置有着不同的机制。BI2536、BI6727，由勃林格殷格翰公司开发，是对 Plk1 具有纳摩尔效力的两酮衍生物，他们都是 ATP 竞争性抑制剂，目前用于临床研究对癌症的治疗。BI2536 与铰链区结合，通过两个特定的氢键与半胱氨酸 133 和 CH OC 链接形成一个杂环，
13、与谷氨酸 131 的相互作用。蝶啶酮和环戊基环在腺嘌呤与核糖部分的 ATP 通道，而哌啶环浸泡在溶剂。蝶啶酮具有 -与苯丙氨酸 183 相互作用。环戊基环和乙基分别在两个疏水通道。氢键的桥接可以通过BI2536 和赖氨酸 82 羰基之间观察。苯基环则夹在亮氨酸 59 和精氨酸 136 的侧链之间。甲氧基，这是所谓的 PLK1 选择性在亮氨酸 132 的铰链区创造的通道口。酰胺的连接具有亮氨酸59 和精氨酸 57 的双氢键。BI6727 具有类似 BI2536 的结合模式，因为它们有一个非常相似的支架。该复合物可溶解部分被选为用于提高某化合物的药代动力学性质但不改变其生化性质和细胞分布。虽然在铰
14、链区，三氢键的结合可以从强效 PLK1 NCD 抑制剂和蛋白质之间观察。其他不同支架材料的 Plk1 NCD 抑制剂与 BI2536 的具有不同的相互作用。ASP194 和谷氨酸 140 氢键结合形成的 MLN0905 是不能在 BI2536 与 Plk1 配合物的晶体结构下观察的。如果我们将这些与Plk1 NCD 抑制剂结合，可以惊奇的发现，除了在铰链区的三氢键和堆积作用外，不同的残基具有不同的相互作用。然而，它们中没有被 ATP 的磷酸基团所占据的。化合物 17 是经过化合物 16 的稠环双环分离形成的，从而提高相对激酶宽板以及相对与Plk2 和 Plk3 异构体的选择性。使用替代环系统是
15、多样性演化的一种有效方法。RO5203280，最近报道的选择性 PLK1 抑制剂，应该经 BI2536 通过改变酮核心到嘧啶核心的转变来修饰。这是一个轻微的修改，但两者的选择性和亲和力都得到改进。TAK-960 是一种在 RO5203280 中间苯环具有额外的氟原子的化合物。目前正在进行恶性实体肿瘤在成熟期第一阶段的评估。SBE13，基于结构的方法进行识别和优化，是一种消极 PLK1 II 型抑制剂。 LFM-A13，另一种由分子建模鉴定的化合物，是一个小的 ATP 竞争 PLK1 抑制剂。20 和 21，特别是 21，在BI2536 中有着不同的支架，等。这里并没有两种化合物对 PLK1 的
16、结合模式的 X 射线晶体结构。这也许是多样性跳增的一个例子。化合物 12-20 是有效的 PLK1 NCD 抑制剂，其中，除了 15 和 20，它们都含有一个哌嗪环或类似的哌啶环。15 和 20 有一个基本的胺基。这是在没有可用的晶体结构情况下的假设，这些基本的群体将在相同的结合方式的蛋白下相互作用。然而，据透露，12，13 的六元环，和 19 是向不同方向和深度的溶剂，而 16 分别与谷氨酸 140 和二甲基氨基丙基组 15 形成一个氢键哌嗪环。2.4 Plk1 抑制剂与 PBD 的结合Plk1 的 PBD 被证明对特定亚细胞的定位和有丝分裂都是必要的。因此，它的抑制作用已经被提议作为小分子
17、对 Plk1 抑制的一种替代方法。Plk 类是包括 PBD 类在内的唯一的蛋白激酶，因此结合 PBD 与天然 Plk1 产物竞争可以提高 Plk1 的特异性抑制作用。因此，Plk1 PBD一直被认为是抗癌治疗的一个潜在的替代目标。Plk1 PBD 由大约 80 个残基的两个 polo-box主链组成，Plk1 PBD 抑制剂可以阻断蛋白质与蛋白质的相互作用。PBIP1，作为 PBD 与蛋白相互作用的分离物，是 Plk1 和特定染色体丝粒定位的关键点。Plk1 PBD 以磷酸化依赖的方式结合到 PBIP1 中的 78 区。不同的磷酸化，包括 T78 的 PBIP1的一个着丝粒蛋白可以绑定 Plk
18、1 的 PBD，在形成直接的和桥接的氢键网络，可在赖氨酸540，色氨酸 414，精氨酸 516，ASP 416 的 PB1 和 PB2 图案之间以及亮氨酸 491 形成的间隙。带负电荷的 PLHSpT 的 PT 与磷酸基团的磷酸化是很重要的。包含 PS / Pt-P / X 一致序列的磷酸肽的相应底物已经得到开发。从 PLHSpT 的组氨酸的咪唑环经烷基化产生，一个意想不到的化合物 23 形成(CH2 )8C6H5，以 0.017uM 的 IC50值抑制 PBD。另一个类似的化合物 24 从 PLHSpT Pro 残基延伸得到 O(CH2)4C6H5，抑制 Plk1 PBD 的 IC50值为
19、0.014uM。这两种化合物都是非常灵活的，但有着两个效力增强的数量级。X 射线晶体学研究表明，23 和 24 的两条长疏水链都可以适合一条能够阻隔 unliganded 蛋白的 X 射线结构的疏水管道。这一长结合通道的新发现是意料之外的，但它的投入使用将大大提高新 Plk1 PBD 抑制剂的结合亲和力，可以提供特定的PBD PLK1 抑制剂设计的一种新范式。最近，许多环状磷酸作为 Plk1 PBD 抑制剂。这些环状磷酸肽，例如 PL-5，修改自 PLHSpT 硫醚桥环。PLHSpT 在母体化合物循环约束了对 Plk1 PBD 的抑制和选择性。通过环化限制抑制剂的构象是一种多样性演变。巧妙的部
20、署可以降低熵的障碍物，显着增加结合的亲和力。到目前为止，只有五种小的类似药物的化合物作为 Plk1 的 PBD 抑制剂。百里醌，提取自目前在 I 期临床研究的黑种草的天然产物，以 IC50值为 0.014uM 描述 Plk1 PBD 的抑制力。百里醌是分子量为 164.21 的一个小的中性化合物，比 PLHSpT 小得多，但它具有比 PLHSpT 更高的与 PBD 的亲和力。由于该化合物是迈克尔受体且其结构与磷酸化完全不同，提供了通过共价修饰与 Plk1 PBD 结合的方式。然而，X 射线晶体结构可以显示它与 Plk1 PBD 结合的荧光识别位点。PLHSpT 的结合证明，Plk1 PBD 的
21、抑制剂结合位点是磷酸基团的识别位点疏水性的一半和带正电的一半组成的。百里醌和 poloxin 的一种水解产物，在对于天然结构的磷酸基团结合的识别位点没有明显中断的 PBD 相互结合，但它们显然不模拟电荷的磷酸组。两个化合物都缺乏一个磷酸基团的负电荷，且并不以氢键与组氨酸 538 和赖氨酸 540 结合，但与色氨酸 414之间有一个桥键。然而，经过量子力学的重新计算表明，阳离子- 与质子化赖氨酸 540 和两种抑制剂相互作用能形成稳定的配合物。除此之外，两种抑制剂能够穿透慢慢移动它们形成的水晶体的氢键网络，最终将它们锁定在一个保守的水分子内。其他抑制剂如 28，29，和 30 可能对 Plk1
22、PBD 有类似的约束机制，因为他们有相似的结构。2.5 PLK1 抑制剂的结合机制尚不清楚除了以上讨论的 Plk1 的 NCD 和 PBD 抑制剂，有一些报道称 PLK1 抑制剂的结合机制尚不清楚。其中，ON01910 以 9-10nM 的 IC50值抑制 Plk1 的非 ATP 竞争行为。该化合物目前用于癌症治疗的 III 期临床试验。HMN-214 是 HMN-176 的一种前药。它影响 Plk1 基因的亚细胞定位，但其确切机制尚不清楚。I2 是通过虚拟筛选鉴定的 PLK1 抑制剂。该化合物出相对 ON01910 对不同的肿瘤细胞有等效的抑制作用。作者认为，这种化合物可能有双重作用，因为它
23、对 ATP和 hPlk1 PBD 都有较高的结合亲和力。我们不可能讨论这些化合物的多样性演变和跳增，因为我们不知道它们是如何与 Plk1 结合的。3.论述PLK1 在增殖细胞与多种癌症中高度表达；下调 PLK1 能抑制癌细胞和移植瘤的细胞增殖。因此，PLK1，它提供了两个管道，NCD 和特定的 PBD，这昭示了开发抗癌药物的好的开端。到目前为止，针对 NCD 的药物开发已经获得成功，有几个结构不同的抑制剂正在临床试验中。这些化合物是 ATP 的模拟，在与 ATP 的结合中分离自 Plk1 PBD，除了一些磷酸，只有五种小的类似药物的化合物支持 Plk1 PBD 抑制剂。其中，百里醌在被报道为
24、Plk1 PBD 抑制剂之前就被送到临床 I 期试验了。天然产物在发展 Plk1 的 NCD 和 PBD 抑制剂的过程中发挥了重要作用。ATP 竞争性抑制剂是基于 ATP 的结合机制设计；但直到现在，没有小的磷酸化类似药物被合成，磷酸肽多样性演变的三种天然产物已经得到支持。由于抑制剂与 Plk1 管道结合的多样性和相似性，他们提供了在药物发现过程中的自然产物的多样性演变和跳增的优秀示范。ATP，细胞内的一种辅酶，在 pH 值等于 7.4 的环境中是一种高度带负电荷的分子。ATP，合成 ATP 竞争性 Plk1 抑制剂，与渥曼青霉素的天然产物具有完全不同的化学结构。主要原因是没有成熟 Plk1
25、NCD 抑制剂在空腔中，ATP 的磷酸基团占据除渥曼青霉素外的空腔，其中共价结合到蛋白质腔。从 ATP 到渥曼青霉素，和从 ATP 到合成的 ATP 竞争 PLK1 抑制剂，都可以确认为多样性跳增。然而，ATP 合成 ATP 竞争 PLK1 抑制剂的结构仍有一些共同之处，主要表现在它们可以与谷氨酸 131 残基和 Cys 133 激酶的铰链区形成两个或三个氢键。其实，最有效的 PLK1 NCD 抑制剂在铰链区形成三个氢键。然而，它通常是不包括在药效建模程序内的氢键。这确实是对于这样的程序的一个解决方式。BI2536 和 BI6727 有相同的支架；它们的区别在于支架上的两个不同的取代基。取代基
26、的改变主要是基于提高对目标性能和药代动力学的亲和力的目的。对于 BI2536 和 BI6727，这是一个多样性演变。本文从探讨 PLK1 NCD 抑制剂的结构，可以很直观的发现，除了与铰链区的基团形成三个氢键，这些结构的共同点是每个化合物具有碱性氮组，以及在大部分时间里这个群体处于不饱和的六元环状态。它不仅可以通过人的眼睛，还可以通过对这些基群以相同的方式与蛋白质作用的建模程序，产生错误的判断。然而，X-射线晶体结构显示，除了线性基本组和一个环胺，所有的不饱和的六元环在暴露溶剂的不同方向和深度，表明共同的结构有时也可以指多样性。Plk1 PBD 是药物设计中不存在其他激酶的一个独特的通道。Pl
27、k1 抑制剂在通道的结合表明了在这些抑制剂中有一个巨大的多样性跳增。许多磷酸化的蛋白称为 PBIP1 可以绑定到Plk1 的 PBD。PLHSpT 延伸的组氨酸和脯氨酸残基使用柔性的长疏水链可以显著提高亲和力。这种通过到达疏水管道发生的多样性进化被阻挡在 unliganded 蛋白内。百里醌和其他四种已经确定的 Plk1 PBD 抑制剂从规模和结构上与 PLHSpT 明显不同，但百里醌和 PLHSpT 的磷酸基团 Plk1 PBD 的活性位点结合在同一位置。不寻常的阳离子- 与醌和带正电荷的赖氨酸 540 之间的相互作用对于 Plk1 PBD 的结合是很重要的。这是不寻常的荧光模拟机制，它提供
28、的醌的磷酸化肽与 Plk1 PBD 结合的竞争活力的新视角。然而，它为计算药物设计尤其是药效团模型裂纹提供了一个难题。4.结论从发生在 Plk1 NCD 和 PBD 抑制剂的发展舞台上，可以得出这样的结论：多样性演化和跳增是先导化合物优化识别过程中常见的事情。多样性的演变往往导致配体具有更好的亲和性或改进的物理化学性质，但结构的改动是有限的。然而，多样性跳增意味着主支架戏剧性的变化。多样性演变的理论基础是药效团模型和合理的药物设计。它发生的几个原因如下：1、活性位点可能有许多的管道和渠道，不同的抑制剂可能占据了它们中的一些；2、我们可以看到，在与 ATP 结合裂的铰链区，不同的生物同电异素与谷
29、氨酸 131 和胱氨酸 133 结合有三种氢键。3、使用不同的连接器。例如，设计肽模拟物来克服多肽药物的缺点，肽的酰胺基团可以修改其他连接器；4、不同取代基的放置在一个支架；5、替代环系统可以使用；6、结构可以简化使其更加稳定。多样性跳增的产生有时候是有直观原因的。最主要的原因之一可能是特定的或成熟的配体不占用模版分子的主体。例如，合成 PLK1 的 ATP 竞争性激酶抑制剂只会占用一小部分 ATP 腔；然而，合成的 ATP 竞争性激酶 Plk1 抑制剂的主体，在其他一些通道中不被 ATP 所占用。这种情况类似与多样性进化发生的一个原因但具有不同的程度，这意味着多样性进化有时会导致严重的多样性
30、跳增。多样性跳的另一个明显的原因是，不同的配体具有不同的结合机制。例如，大部分的合成ATP 竞争 PLK1 抑制剂是可逆的，而 Plk1 酶共价修饰的渥曼青霉素是一个典型的不可逆抑制剂，表明也是有不可逆的抑制剂的。不可逆抑制剂通常含有反应性官能团的。然而，不是所有具有反应性官能团的化合物都是不可逆的。这里举的例子是醌，醌的醌环是迈克尔受体，可与硫醇基的半胱氨酸残基发生反应。然而，与预料中相反的是，在 Plk1 的 PBD 的活性部位，该化合物具有与蛋白质没有共价键。这两种化合物的对象都不是由醌环的化学变化引起的。如果考虑到百里醌和磷酸在 Plk1 PBD 活性位点之间结合的差异，这并不是多样性发生跳增的直观的方式。这是我们对蛋白质-配体相互作用的理解和进一步开发药物设计的工具的一个挑战。
