动物免疫学实验指导.doc

1、动动动 物物物 免免免 疫疫疫 学学学 实实实 验验验 指指指 导导导第 二 版徐 春 厚 谢 为 天 雍 艳 红 编动 物 医 学 生 物 技 术 专 业 用广 东 海 洋 大 学 教 材 科 出 版二 00 七 年 二 月 二 十 八 日1目 录实 验 一 凝 集 试 验 1实 验 二 沉 淀 试 验 4实 验 三 溶 血 试 验 8实 验 四 病 毒 的 血 凝 及 血 凝 抑 制 试 验 10实 验 五 E-玫 瑰 花 环 试 验 13实 验 六 EA 玫 瑰 花 环 试 验 15实 验 七 EAC 玫 瑰 花 环 试 验 17实 验 八 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 18实 验 九

2、 荧 光 抗 体 技 术 20实 验 十 多 克 隆 抗 体 （ 免 疫 血 清 ） 的 制 备 222实 验 一 凝 集 试 验颗 粒 性 抗 原 (细 菌 、 螺 旋 体 、 红 细 胞 等 )与 相 应 抗 体 结 合 后 ， 在 有 适 量 电 解 质 存 在 下 ，抗 原 颗 粒 可 相 互 凝 集 成 肉 眼 可 见 的 凝 集 块 ， 称 为 凝 集 反 应 (Agglutination reaction)或 凝 集 试验 。 参 与 凝 集 反 应 的 抗 原 称 为 凝 集 原 （ Agglutinogen） ， 抗 体 称 为 凝 集 素 （ Agglutinin） 。细

3、菌 或 其 它 凝 集 原 都 带 有 相 同 的 负 电 荷 ， 在 悬 液 中 相 互 排 斥 而 呈 现 均 匀 的 分 散 状 态 。 抗原 与 相 应 抗 体 相 遇 后 可 以 发 生 特 异 性 结 合 ， 形 成 抗 原 抗 体 复 合 物 ， 降 低 了 抗 原 分 子 间 的 静 电 排斥 力 ， 此 时 已 有 凝 集 的 趋 向 ， 在 电 解 质 （ 如 生 理 盐 水 ） 参 与 下 ， 由 于 离 子 的 作 用 ， 中 和 了 抗 原抗 体 复 合 物 外 面 的 大 部 分 电 荷 ， 使 之 失 去 了 彼 此 间 的 静 电 排 斥 力 ， 分 子 间 相

4、 互 吸 引 ， 凝 集 成 大的 絮 片 或 颗 粒 ， 出 现 了 肉 眼 可 见 的 凝 集 反 应 。 根 据 是 否 出 现 凝 集 反 应 及 其 程 度 ， 对 待 测 抗 原或 待 测 抗 体 进 行 定 性 、 定 量 测 定 。凝 集 反 应 包 括 直 接 凝 集 反 应 和 间 接 凝 集 反 应 两 大 类 ， 本 实 验 主 要 介 绍 直 接 凝 集 反 应 。目 的 要 求 1. 掌 握 平 板 凝 集 试 验 和 试 管 凝 集 试 验 的 操 作 方 法 。2. 掌 握 凝 集 试 验 的 结 果 判 定 及 判 定 标 准 。3. 熟 悉 平 板 凝 集

5、试 验 和 试 管 凝 集 试 验 所 需 材 料 和 试 剂 。材 料 与 试 剂 1. 玻 板 ， 载 玻 片 ， 试 管 （ 1cm x 8cm） ， 试 管 架 ， 刻 度 吸 管 ， 滴 管 ， 微 量 可 调 加 样 器 ，滴 头 （ tip 头 ） ， 牙 签 或 火 柴 棒 ， 记 号 笔 。2. 灭 菌 的 生 理 盐 水 ， 灭 菌 的 0.5%石 炭 酸 生 理 盐 水 。3. 布 氏 杆 菌 病 试 管 凝 集 抗 原 ， 布 氏 杆 菌 病 平 板 凝 集 抗 原 ， 布 氏 杆 菌 病 虎 红 平 板 凝 集 抗 原 ，布 氏 杆 菌 病 阳 性 血 清 ， 布 氏

6、 杆 菌 病 阴 性 血 清 ， 被 检 血 清 （ 牛 、 羊 或 猪 ） 。4. 鸡 白 痢 平 板 凝 集 抗 原 ， 鸡 白 痢 阳 性 血 清 ， 鸡 白 痢 阴 性 血 清 ， 被 检 鸡 血 清 。实 验 内 容 及 操 作 方 法 （ 一 ） 试 管 凝 集 试 验以 牛 布 氏 杆 菌 病 试 管 凝 集 试 验 为 例 。1. 试 管 准 备 ： 每 份 血 清 用 试 管 4 支 ， 另 取 3 支 试 管 作 为 对 照 ， 作 好 标 记 ， 置 试 管 架 上 。如 被 检 血 清 有 多 份 ， 对 照 只 需 做 1 份 。32. 被 检 血 清 稀 释 ： 第

7、 1 管 加 入 2.3 ml 0.5% 石 炭 酸 生 理 盐 水 ， 第 2、 3、 4 管 加 入 0.5 ml 0.5% 石 炭 酸 生 理 盐 水 ； 然 后 用 加 样 器 或 刻 度 吸 管 吸 取 被 检 血 清 0.2 ml ， 加 入 第 1 管 中 ，反 复 吹 吸 5 次 混 匀 ， 吸 取 1.5 ml 弃 之 ， 再 吸 取 0.5 ml 加 入 第 2 管 中 ， 混 匀 后 吸 取 0.5 ml 加 入 第 3 管 ， 依 此 类 推 至 第 4 管 ， 混 匀 后 吸 弃 0.5 ml （ 见 表 1-1） 。 该 被 检 血 清 的 稀 释 度 分别 是 1

8、:12.5、 1:25、 1:50、 1:100。3. 对 照 管 制 作 ： 第 5 管 中 加 0.5% 石 炭 酸 生 理 盐 水 0.5 ml ， 第 6 管 加 1:25 稀 释 的 布氏 杆 菌 病 阳 性 血 清 0.5 ml ， 第 7 管 加 1:25 稀 释 的 布 氏 杆 菌 病 阴 性 血 清 0.5 ml 。4. 加 抗 原 ： 将 布 氏 杆 菌 病 试 管 凝 集 抗 原 用 0.5% 石 炭 酸 生 理 盐 水 作 1:20 稀 释 ， 每 支 试管 加 0.5 ml 。表 1-1 布 氏 杆 菌 病 试 管 凝 集 试 验 术 式 表 （ 单 位 ： ml）试

9、 管 号 1 2 3 4 5 6 7对 照 管最终血清稀释度 1：25 1：50 1：100 1：200 阳性血清 阴性血清抗 原1：25 1：250.5%石炭酸生理盐水 2.3 0.5 0.5 0.5 0.5被检血清 0.2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5抗原(1：20) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5弃 1.5 弃 0.55. 感 作 （ 反 应 ） ： 7 支 试 管 加 完 抗 原 后 ， 充 分 混 匀 ， 置 于 37 温 箱 中 4-10h， 取 出 后置 室 温 18-24h（ 或 37 温 箱 12-14h， 取 出 后 置 室 温 2-4h；

10、 或 37 温 箱 中 22-24 h 取 出 ） ，然 后 观 察 并 记 录 结 果 。6. 结 果 判 定 ： 判 定 结 果 时 用 “+”表 示 反 应 的 强 度 。 根 据 各 管 中 上 清 液 的 透 明 度 、 抗 原被 凝 集 的 程 度 及 凝 集 块 的 形 状 ， 来 判 定 凝 集 反 应 的 程 度 。 ： 100 抗 原 凝 集 ， 上 清 液 完 全 透 明 ， 菌 体 完 全 被 凝 集 呈 伞 状 沉 于 管 底 ， 振 荡 时 ，沉 淀 物 呈 片 状 、 块 状 或 颗 粒 状 。 ： 75 抗 原 凝 集 ， 上 清 液 略 呈 混 浊 ， 菌 体

11、 大 部 分 被 凝 集 沉 于 管 底 ， 振 荡 时 情 况 如上 。 （ 管 底 凝 集 物 与 100%凝 集 时 相 同 ， 只 是 上 清 液 稍 浑 浊 ） 。 ： 50 抗 原 凝 集 ， 上 清 液 浑 浊 半 透 明 ， 管 底 有 中 等 量 的 凝 集 物 （ 管 底 有 明 显 的 凝 集 ）。4 ： 25 抗 原 凝 集 ， 上 清 液 完 全 浑 浊 不 透 明 ， 管 底 有 少 量 凝 集 物 或 凝 集 的 痕 迹 。 ： 抗 原 完 全 未 凝 集 ， 上 清 液 完 全 浑 浊 不 透 明 ， 但 由 于 菌 体 的 自 然 下 沉 ， 在 管 底 中

12、央出 现 规 则 的 菌 体 自 沉 圆 点 ， 振 荡 后 立 即 散 开 呈 均 匀 混 浊 。7. 判 定 标 准 ： 能 使 50% 抗 原 凝 集 的 血 清 最 高 稀 释 度 称 为 该 血 清 的 凝 集 价 （ 或 称 滴 度 ） 。牛 、 马 和 骆 驼 的 血 清 凝 集 价 大 于 或 等 于 1:100， 判 为 阳 性 ， 1:50 的 凝 集 价 判 为 疑 似 反应 （ 可 疑 ） ； 猪 、 绵 羊 、 山 羊 和 狗 的 血 清 凝 集 价 大 于 或 等 于 1:50， 判 为 阳 性 ， 1:25 的 凝 集价 判 为 疑 似 反 应 （ 可 疑 ） 。

13、注 意 事 项 1. 实 验 时 必 须 设 抗 原 、 阳 性 血 清 及 阴 性 血 清 对 照 ， 以 避 免 假 阳 性 、 假 阴 性 的 结 果 。2. 结 果 判 为 可 疑 时 ， 隔 2-3 周 后 采 血 重 做 。 阳 性 畜 群 ， 重 检 时 仍 为 可 疑 ， 可 判 为 阳 性 。对 同 群 中 既 无 临 床 症 状 又 无 凝 集 反 应 阳 性 者 ， 马 、 猪 重 检 仍 为 可 疑 ， 判 阴 性 ； 牛 、 羊 重 检 仍 为可 疑 者 ， 可 判 为 阳 性 ， 或 以 补 体 结 合 反 应 核 对 。（ 二 ） 布 氏 杆 菌 病 平 板 凝

14、集 试 验1. 加 血 清 ： 取 洁 净 玻 板 一 块 ， 用 蜡 笔 划 成 方 格 （ 4cm2） ， 并 注 明 被 检 血 清 号 码 ， 以100L 微 量 可 调 加 样 器 按 下 列 量 加 被 检 血 清 于 方 格 内 ， 第 l 格 80L、 第 2 格 40L、 第 3格 20L、 第 4 格 10L。 血 清 用 前 需 放 室 温 ， 使 其 温 度 达 20 左 右 。 每 一 份 检 样 需 换 一 个tip 头 。大 规 模 检 疫 时 ， 允 许 只 用 两 个 血 清 量 作 试 验 ， 牛 、 马 、 骆 驼 用 40L 和 20L ； 猪 、 山羊

15、 、 绵 羊 、 狗 用 80L 和 40L。2. 加 抗 原 ： 每 格 加 布 氏 杆 菌 病 平 板 凝 集 抗 原 30L， 滴 在 血 清 附 近 ， 而 不 与 血 清 接 触 。从 血 清 量 最 少 的 一 格 起 ， 用 牙 签 将 血 清 与 抗 原 混 匀 ， 一 份 血 清 用 一 根 牙 签 。抗 原 用 前 摇 匀 ， 并 置 室 温 使 其 温 度 达 20 左 右 。3. 作 用 ： 混 和 完 毕 后 ， 将 玻 板 置 恒 温 箱 中 或 采 用 别 的 办 法 适 当 加 温 ， 使 温 度 达 到 30左 右 ， 3-5min 内 记 录 反 应 结 果

16、 。4. 对 照 ： 每 次 试 验 须 用 标 准 阳 性 血 清 和 阴 性 血 清 以 及 生 理 盐 水 作 对 照 。5. 结 果 判 定 ： 按 下 列 标 准 记 录 反 应 结 果 。 ： 出 现 大 的 凝 集 块 ， 液 体 完 全 透 明 ， 即 100% 凝 集 。 ： 有 明 显 凝 集 块 ， 液 体 几 乎 完 全 透 明 ， 即 75% 凝 集 。5 ： 有 可 见 凝 集 块 ， 液 体 不 甚 透 明 ， 即 50% 凝 集 。 ： 液 体 混 浊 ， 有 小 的 颗 粒 状 物 ， 即 25% 凝 集 。 ： 液 体 均 匀 混 浊 ， 无 凝 集 现 象

17、 。6. 平 板 凝 集 试 验 与 试 管 凝 集 试 验 的 关 系 见 表 1-2。表 1-2 平 板 凝 集 试 验 与 试 管 凝 集 试 验 的 关 系平 板 凝 集 80L 40L 20L 10L相 当 于 试 管 凝 集 1:25 1:50 1:100 1:2007. 判 定 标 准 ： 同 试 管 凝 集 试 验 。8. 注 意 ： 对 于 阳 性 及 可 疑 的 被 检 血 清 需 用 试 管 凝 集 试 验 进 行 验 证 。（ 三 ） 虎 红 平 板 凝 集 试 验这 种 试 验 是 快 速 平 板 凝 集 试 验 。 抗 原 是 布 氏 杆 菌 加 虎 红 制 成 。

18、 虎 红 平 板 凝 集 试 验 可 与 试管 凝 集 试 验 及 补 体 结 合 试 验 效 果 相 比 ， 具 有 操 作 简 单 、 快 速 、 特 异 性 强 的 优 点 。1. 被 检 血 清 和 布 氏 杆 菌 病 虎 红 平 板 凝 集 抗 原 各 30L 滴 于 玻 璃 板 的 方 格 内 ， 每 份 血 清 各用 一 支 牙 签 或 火 柴 棒 混 合 均 匀 。 在 室 温 （ 20 ） 4-10min 内 记 录 反 应 结 果 。 同 时 以 阳 、 阴 性血 清 作 对 照 。 2. 结 果 判 定 ： 在 阳 性 血 清 及 阴 性 血 清 试 验 结 果 正 确

19、的 前 提 下 ， 被 检 血 清 出 现 任 何 程 度 的凝 集 现 象 均 判 为 阳 性 ， 完 全 不 凝 集 的 判 为 阴 性 ， 无 可 疑 反 应 。3. 注 意 ： 抗 原 用 前 充 分 摇 匀 ， 抗 原 和 被 检 血 清 用 前 应 放 室 温 30-60min 后 再 进 行 试 验 。（ 四 ） 鸡 白 痢 平 板 凝 集 试 验1. 被 检 鸡 血 清 和 鸡 白 痢 平 板 凝 集 抗 原 各 1 滴 （ 约 30L） 滴 于 玻 板 或 载 玻 片 上 ， 用 牙 签或 火 柴 棒 充 分 混 合 。2. 结 果 判 定 ： 在 室 温 （ 20 ） 下

20、， 观 察 30-60s， 凝 集 者 为 阳 性 ， 不 凝 集 者 为 阴 性 。思 考 题 1. 凝 集 反 应 的 原 理 是 什 么 ?2. 哪 些 因 素 影 响 细 菌 凝 集 试 验 ?3. 凝 集 试 验 中 为 什 么 要 设 阳 性 、 阴 性 血 清 及 抗 原 对 照 ？6实 验 二 沉 淀 试 验可 溶 性 抗 原 (如 细 菌 浸 出 液 、 含 菌 病 料 浸 出 液 、 病 毒 、 血 清 以 及 其 他 来 源 的 蛋 白 质 、 多糖 、 类 脂 等 )与 其 相 应 的 抗 体 结 合 后 ， 在 电 解 质 参 与 下 ， 形 成 肉 眼 可 见 的

21、白 色 沉 淀 ， 称 为 沉 淀反 应 (Precipitation reaction)。 沉 淀 反 应 中 的 抗 原 称 为 沉 淀 原 （ Precipitinogen） ， 抗 体 称 为 沉淀 素 （ Precipitin） 。沉 淀 反 应 主 要 包 括 有 环 状 沉 淀 试 验 、 琼 脂 扩 散 沉 淀 试 验 及 免 疫 电 泳 等 。目 的 要 求 1. 掌 握 炭 疽 环 状 沉 淀 试 验 的 操 作 方 法 和 结 果 观 察 。2. 掌 握 琼 脂 扩 散 沉 淀 试 验 的 原 理 和 操 作 方 法 。3. 了 解 对 流 免 疫 电 泳 的 般 原 理

22、 和 操 作 技 术 。材 料 与 试 剂 1. 口 径 0.4cm 的 小 试 管 ， 毛 细 滴 管 ， 载 玻 片 ， 平 皿 ， 烧 杯 没 ， 打 孔 器 ， 针 头 ， 酒 精 灯 ，加 样 器 （ 移 液 器 ） ， 滴 头 ， 电 泳 槽 ， 电 泳 仪 等 。2. 生 理 盐 水 ， 8.5% NaCl 溶 液 ， 0.5% 石 炭 酸 生 理 盐 水 ， 巴 比 妥 缓 冲 液 ， 琼 脂 粉 等 。3. 炭 疽 沉 淀 抗 原 （ 炭 疽 标 准 抗 原 ） ， 炭 疽 沉 淀 素 血 清 ， 待 检 抗 原 。4. 禽 流 感 琼 扩 抗 原 ， 禽 流 感 阳 性 血

23、 清 ， 待 检 鸡 血 清 ； 兔 抗 猪 IgG， 猪 血 清 ， 鸡 血 清 ，兔 血 清 、 牛 血 清 ， 羊 血 清 等 。5. 小 鹅 瘟 琼 扩 抗 原 ， 小 鹅 瘟 抗 血 清 ； 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 琼 扩 抗 原 （ 或 待 检 法 氏 囊 组 织浸 提 液 ） ， 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 阳 性 血 清 。实 验 内 容 及 操 作 方 法 （ 一 ） 环 状 沉 淀 试 验环 状 沉 淀 试 验 (Ring precipitation test)是 最 早 的 沉 淀 反 应 。 目 前 在 链 球 菌 的 分 类 、 鉴 定 ，昆 虫 吸 血

24、性 能 及 所 吸 血 液 来 自 何 种 动 物 的 鉴 别 ， 肉 品 种 属 鉴 定 及 炭 疽 尸 体 与 皮 张 的 检 验 工 作 中仍 然 应 用 。 以 炭 疽 环 状 沉 淀 反 应 为 例 ， 此 反 应 又 称 Ascoli 氏 反 应 。1. 待 检 抗 原 的 制 备7(1) 取 疑 为 炭 疽 死 亡 动 物 的 实 质 脏 器 1g 放 入 小 烧 杯 中 剪 碎 ， 加 生 理 盐 水 5-10ml， 煮 沸30min， 冷 却 后 用 滤 纸 过 滤 使 之 呈 清 澈 透 明 的 液 体 ， 即 为 待 检 抗 原 。(2) 如 待 检 材 料 是 皮 张

25、、 兽 毛 等 ， 可 采 用 冷 浸 法 。 先 将 样 品 高 压 灭 菌 30min 后 ， 皮 张剪 为 小 块 并 称 重 ， 加 5-10 倍 的 0.5% 石 炭 酸 生 理 盐 水 ， 置 室 温 浸 泡 10-24h。 用 滤 纸 过 滤2-3 次 ， 使 之 呈 清 朗 的 液 体 ， 此 即 为 待 检 抗 原 。2. 加 样 ： 取 3 支 口 径 0.4cm 的 小 试 管 ， 在 其 底 部 各 加 约 0.1 ml 的 炭 疽 沉 淀 素 血 清 (用毛 细 滴 管 加 ， 注 意 液 面 勿 有 气 泡 )。 取 其 1 支 ， 用 毛 细 滴 管 将 待 检

26、抗 原 沿 着 管 壁 轻 轻 加 入 使重 叠 在 炭 疽 沉 淀 素 血 清 之 上 ， 上 下 两 液 间 有 一 整 齐 的 界 面 ， 注 意 勿 产 生 气 泡 。 另 2 支 小 试管 ， 一 支 加 炭 疽 沉 淀 抗 原 ， 另 一 支 加 生 理 盐 水 ， 方 法 同 上 ， 作 为 对 照 。3. 结 果 判 定 ： 5-10min 内 判 定 结 果 ， 上 下 重 叠 两 液 界 面 上 出 现 乳 白 色 环 者 ， 为 炭 疽 阳 性 。对 照 组 中 ， 加 炭 疽 沉 淀 抗 原 者 应 出 现 白 环 ， 而 加 生 理 盐 水 者 应 不 出 现 白 环

27、 。4. 注 意 ： 观 察 结 果 时 ， 可 将 一 只 手 放 在 小 试 管 对 测 的 适 当 位 置 上 遮 挡 光 线 ， 有 利 于 看 到白 色 沉 淀 环 。（ 二 ） 琼 脂 扩 散 沉 淀 试 验琼 脂 扩 散 沉 淀 试 验 （ Agar gel precipitation test， AGPT） 是 沉 淀 反 应 的 一 种 形 式 。 物 质自 由 运 动 形 成 扩 散 现 象 ， 扩 散 可 以 在 各 种 介 质 中 进 行 。 1% 琼 脂 凝 胶 形 成 网 状 构 架 ， 空 隙 中是 98%-99% 的 水 ， 允 许 分 子 量 在 200ku

28、以 下 分 子 通 过 。 绝 大 多 数 可 溶 性 抗 原 和 抗 体 的 分 子量 在 200ku 以 下 ， 因 此 可 以 在 琼 脂 凝 胶 中 自 由 扩 散 ， 所 受 阻 力 甚 小 。 二 者 在 琼 脂 凝 胶 中 相 遇 ，在 最 适 比 例 处 结 合 成 复 合 物 ， 此 复 合 物 因 颗 粒 较 大 而 不 能 扩 散 ， 故 形 成 沉 淀 带 。本 试 验 可 用 已 知 抗 体 检 测 样 品 中 的 抗 原 ， 也 可 用 已 知 抗 原 检 测 血 清 样 品 中 的 抗 体 。1. 琼 脂 板 制 备 ： 称 取 1g 琼 脂 粉 ， 加 入 10

29、0ml 生 理 盐 水 或 8.5% NaCl 溶 液 （ 禽 类 ） ， 煮沸 使 之 溶 解 。 待 溶 解 的 琼 脂 温 度 降 至 60 左 右 时 倒 入 平 皿 中 ， 厚 度 为 2-3mm。2. 打 孔 ： 用 打 孔 器 在 琼 脂 凝 胶 板 上 按 7 孔 梅 花 图 案 打 孔 ， 孔 径 约 3-5mm， 中 心 孔 和 周围 孔 间 的 距 离 约 为 3-5mm。 挑 出 孔 内 琼 脂 凝 胶 ， 注 意 不 要 挑 破 孔 的 边 缘 。3. 封 底 ： 在 火 焰 上 缓 缓 加 热 ， 使 孔 底 琼 脂 凝 胶 微 微 融 化 ， 以 防 止 孔 底

30、边 缘 渗 漏 。4. 加 样 ： 以 毛 细 滴 管 （ 或 加 样 器 ） 将 样 品 加 入 孔 内 ， 注 意 不 要 产 生 气 泡 ， 以 加 满 为 度 。（ 1） 血 清 流 行 病 学 调 查 ： 将 禽 流 感 琼 扩 抗 原 置 中 心 孔 ， 周 围 1、 3、 5 孔 加 禽 流 感 阳 性血 清 ， 2、 4、 6 孔 分 别 加 待 检 鸡 血 清 ， 每 加 一 个 样 品 应 换 一 个 滴 头 。（ 2） 抗 血 清 效 价 测 定 ： 将 猪 血 清 （ 抗 原 ） 加 入 中 心 孔 ， 将 兔 抗 猪 IgG（ 抗 体 ） 作 2 倍8比 稀 释 ，

31、即 l:2、 1:4、 1:8、 l:16、 1:32 等 ， 分 别 加 至 周 围 孔 中 。 或 者 是 将 小 鹅 瘟 琼 扩 抗原 加 入 中 心 孔 ， 周 围 孔 加 入 l:2、 1:4、 1:8、 l:16、 1:32 等 稀 释 的 小 鹅 瘟 抗 血 清 。（ 3） 抗 原 检 测 ： 将 兔 抗 猪 IgG（ 抗 血 清 ） 加 入 中 心 孔 ， 将 待 测 抗 原 （ 猪 血 清 、 鸡 血 清 、兔 血 清 、 牛 血 清 、 羊 血 清 等 ） 置 于 周 围 孔 中 。 或 者 是 将 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 阳 性 血 清 加 入 中 心孔 ， 周

32、围 孔 加 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 琼 扩 抗 原 （ 或 待 检 法 氏 囊 组 织 浸 提 液 ） 。 5. 感 作 ： 将 琼 脂 凝 胶 板 加 盖 保 湿 ， 置 于 37 温 箱 ， 24-48h 后 ， 判 定 结 果 。6. 结 果 判 定（ 1） 血 清 流 行 病 学 调 查 ： 待 检 孔 与 阳 性 孔 出 现 的 沉 淀 带 完 全 融 合 者 判 为 阳 性 。 待 检 血清 无 沉 淀 带 或 所 出 现 的 沉 淀 带 与 阳 性 对 照 的 沉 淀 带 完 全 交 叉 者 判 为 阴 性 。（ 2） 抗 血 清 效 价 测 定 ： 以 出 现 沉 淀

33、带 的 血 清 最 高 稀 释 倍 数 为 抗 血 清 的 AGP 效 价 。（ 3） 抗 原 检 测 ： 兔 抗 猪 IgG 与 猪 血 清 孔 之 间 有 明 显 沉 淀 带 ， 与 其 他 血 清 孔 之 间 不 形 成沉 淀 带 。 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 阳 性 血 清 与 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 琼 扩 抗 原 孔 之 间 出 现 沉 淀 带 ， 如 与待 组 织 浸 提 液 孔 之 间 出 现 沉 淀 带 ， 说 明 该 法 氏 囊 组 织 中 有 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 病 毒 抗 原 。（ 三 ） 对 流 免 疫 电 泳在 pH 值 8.6 的 琼 脂

34、 凝 胶 中 ， 抗 体 球 蛋 白 带 有 微 弱 的 负 电 荷 ， 在 电 泳 时 ， 由 于 电 渗 作 用 的影 响 ， 抗 体 球 蛋 白 反 而 向 负 极 倒 退 。 而 一 般 抗 原 蛋 白 质 带 负 电 荷 ， 在 电 泳 力 的 作 用 下 向 正 极 移动 。 二 者 在 两 孔 之 间 相 遇 ， 形 成 肉 眼 可 见 的 白 色 沉 淀 线 。本 法 由 于 抗 原 抗 体 分 子 在 电 场 作 用 下 定 向 运 动 ， 限 制 了 自 由 扩 散 ， 从 而 提 高 了 敏 感 性 ， 它较 琼 脂 扩 散 试 验 敏 感 性 高 10-16 倍 ， 并

35、 可 大 大 缩 短 沉 淀 线 出 现 的 时 间 ， 适 用 于 快 速 诊 断 。1. 琼 脂 板 制 备 ： 用 巴 比 妥 缓 冲 液 配 制 1%-1.5% 琼 脂 凝 胶 板 ， 厚 度 2-3mm。2. 打 孔 ： 孔 径 3-5mm， 孔 距 4-10mm， 一 张 载 玻 片 可 打 12 个 孔 ， 挑 去 孔 内 琼 脂 ， 封 底 。3. 加 样 ： 一 对 孔 中 ， 一 孔 加 已 知 （ 或 待 测 ） 抗 原 ， 另 一 孔 加 待 测 （ 或 已 知 ） 抗 体 。4. 电 泳 ： 在 电 泳 槽 内 加 入 pH 8.6 的 巴 比 妥 缓 冲 液 ， 将

36、 滤 纸 片 放 入 缓 冲 液 内 浸 湿 搭 桥 。将 抗 原 孔 置 于 负 极 端 。 电 压 2.5-6V/cm， 或 电 流 强 度 3-5mA/cm， 电 泳 时 间 为 30-90min 。5. 结 果 观 察 ： 断 电 后 ， 将 凝 胶 板 置 于 灯 光 下 ， 衬 以 黑 色 背 景 观 察 。 阳 性 者 则 在 抗 原 与 抗体 孔 之 间 形 成 一 条 清 楚 致 密 的 白 色 沉 淀 线 。 如 沉 淀 线 不 清 晰 ， 可 将 琼 脂 凝 胶 板 放 在 湿 盒 中37 数 小 时 或 置 电 泳 槽 过 夜 再 观 察 。思 考 题 1. 进 行 环

37、 状 沉 淀 试 验 时 ， 注 意 事 项 是 什 么 ？92. 琼 脂 扩 散 沉 淀 试 验 的 操 作 方 法 及 其 应 用 。 3. 对 流 免 疫 电 泳 的 原 理 是 什 么 ？实 验 三 溶 血 试 验红 细 胞 与 其 相 应 的 抗 体 （ 溶 血 素 ） 发 生 特 异 性 结 合 ， 当 加 入 补 体 时 ， 抗 原 抗 体 复 合 物 通过 经 典 途 径 使 补 体 活 化 ， 产 生 膜 攻 击 作 用 ， 最 后 导 致 红 细 胞 溶 解 ， 发 生 溶 血 反 应 。羊 红 细 胞 或 鸡 细 胞 + 免 疫 血 清 （ 溶 血 素 ） + 豚 鼠 血

38、 清 （ 补 体 ） 溶 血 反 应 。补 体 （ Complement） 是 存 在 于 正 常 人 和 脊 椎 动 物 血 清 及 组 织 液 中 一 组 具 有 酶 原 活 性 的 蛋白 质 ， 以 豚 鼠 血 清 中 的 补 体 成 分 较 全 且 活 性 高 。 由 于 补 体 对 热 敏 感 ， 56 30min 即 被 灭 活 ，室 温 放 置 很 快 失 活 ， 0-10 其 活 性 仅 能 保 持 3-4d， 实 验 时 可 以 采 用 新 鲜 的 豚 鼠 血 清 。目 的 要 求 1. 通 过 溶 血 试 验 ， 掌 握 抗 原 、 抗 体 与 补 体 的 关 系 及 作

39、用 特 点 ， 理 解 和 验 证 补 体 被 激 活后 的 溶 细 胞 作 用 。2. 掌 握 溶 血 试 验 的 操 作 与 观 察 结 果 的 方 法 。材 料 与 试 剂 1. 试 管 ， 试 管 架 ， 可 调 加 样 器 ， 滴 头 ， 滴 管 ， 注 射 器 ， 针 头 等 。2. 灭 菌 生 理 盐 水 ， 2% 山 羊 红 细 胞 悬 液 ， 兔 抗 山 羊 红 细 胞 抗 体 （ 溶 血 素 ） ， 2% 鸡 红 细胞 悬 液 ， 兔 抗 鸡 红 细 胞 抗 体 （ 溶 血 素 ） ， 豚 鼠 血 清 。实 验 内 容 及 操 作 方 法 1. 2% 山 羊 (或 鸡 )红

40、 细 胞 悬 液 的 制 备 ： 无 菌 取 山 羊 (或 鸡 )抗 凝 血 ， 离 心 去 血 浆 ， 沉 淀 用生 理 盐 水 洗 涤 3 次 ， 每 次 2000r/min， 离 心 10min， 然 后 去 掉 上 清 液 ， 血 细 胞 泥 用 生 理 盐 水配 成 2% 的 红 细 胞 悬 液 。2. 溶 血 素 的 制 备 ： 将 免 疫 血 清 （ 溶 血 素 ） 用 生 理 盐 水 稀 释 成 2 单 位 （ 1:500-1:1000） ，56 水 浴 30 min 灭 活 。3. 补 体 的 制 备 ： 将 新 鲜 豚 鼠 血 清 （ 补 体 ） 用 生 理 盐 水 稀 释

41、 成 1:20， 取 1 ml 置 56 水浴 30min 灭 活 。4. 取 小 试 管 5 支 ， 依 次 编 号 。 按 表 3-1 加 入 各 成 分 ， 摇 匀 ， 置 37 水 浴 30min。5. 结 果 观 察 ： 若 管 底 无 红 细 胞 沉 淀 ， 上 层 液 体 红 色 透 明 者 为 完 全 溶 血 。 若 液 体 呈 混 浊 或10放 置 后 管 底 有 红 细 胞 沉 淀 为 不 溶 血 。表 3-1 溶 血 试 验 （ 单 位 ： ml ）试 管 号 1 2溶 血 素 对 照 3补 体 对 照 4盐 水 对 照 5补 、 溶 对 照2%红 细 胞 0.5 0.5

42、 0.5 0.5 0.5溶 血 素 0.5 0.5 0.5补 体 0.5 0.5 0.5*生 理 盐 水 0.5 0.5 1.0 结 果 溶 血 不 溶 血 不 溶 血 不 溶 血 不 溶 血注 ： * 56 30min 灭 活 的 补 体 。思 考 题 1. 溶 血 试 验 中 ， 第 2、 3、 4、 5 管 是 什 么 对 照 ？ 为 什 么 要 设 这 些 对 照 ？2. 溶 血 试 验 的 原 理 是 什 么 ？ 11实 验 四 病 毒 的 血 凝 及 血 凝 抑 制 试 验有 些 病 毒 具 有 凝 集 某 种 (些 )动 物 红 细 胞 的 能 力 ， 称 为 病 毒 的 血 凝

43、 ， 利 用 这 种 特 性 设 计 的试 验 称 血 球 凝 集 (HA)试 验 ， 以 此 来 推 测 被 检 材 料 中 有 无 病 毒 存 在 ， 是 非 特 异 性 的 ， 但 病 毒 的凝 集 红 细 胞 的 能 力 可 被 相 应 的 特 异 性 抗 体 所 抑 制 ， 即 血 球 凝 集 抑 制 (HI)试 验 ， 具 有 特 异 性 。通 过 HA-HI 试 验 ， 可 用 已 知 血 清 来 鉴 定 未 知 病 毒 ， 也 可 用 已 知 病 毒 来 检 查 被 检 血 清 中 的 相 应抗 体 和 滴 定 抗 体 的 含 量 。 目 的 要 求 掌 握 病 毒 HA 和

44、HI 试 验 的 原 理 和 基 本 操 作 方 法 ， 了 解 其 实 用 价 值 。材 料 与 试 剂 1. 96 孔 “U”形 或 “V”形 微 量 反 应 板 ， 50L 定 量 移 液 器 ， 滴 头 ， 微 型 振 荡 器 。2. 生 理 盐 水 ， 0.5% 鸡 红 细 胞 悬 液 。3. 新 城 疫 病 毒 液 （ 尿 囊 液 或 冻 干 疫 苗 液 ） ， 新 城 疫 阳 性 血 清 ， 被 检 鸡 血 清 。实 验 内 容 及 操 作 方 法 （ 一 ） 血 球 凝 集 (HA)试 验 1. 在 96 孔 微 量 反 应 板 上 进 行 ， 自 左 至 右 各 孔 加 50

45、L 生 理 盐 水 。2. 于 左 侧 第 1 孔 加 50L 病 毒 液 （ 尿 囊 液 或 冻 干 疫 苗 液 ） ， 混 合 均 匀 后 ， 吸 50L 至 第2 孔 ， 依 次 倍 比 稀 释 至 第 11 孔 ， 吸 弃 50L； 第 12 孔 为 红 细 胞 对 照 。3. 自 右 至 左 依 次 向 各 孔 加 入 0.5% 鸡 红 细 胞 悬 液 50L， 在 振 荡 器 上 振 荡 ， 室 温 下 静 置后 观 察 结 果 （ 表 4-1） 。表 4-1 病 毒 血 凝 试 验 的 操 作 方 法 （ 单 位 ： L）孔 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1

46、2病毒稀释度 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照生理盐水 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50病毒液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 0.5%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50弃 5012结果观察 + + + + + + + + + + - -4. 结 果 判 定 ： 从 静 置 后 10 min 开 始 观 察 结 果 ， 待 对 照 孔 红 细 胞 已 沉 淀 即 可 进 行 结 果观 察 。

47、 红 细 胞 全 部 凝 集 ， 沉 于 孔 底 ， 平 铺 呈 网 状 ， 即 为 100% 凝 集 （ +） ， 不 凝 集 者 （ -） 红 细 胞 沉 于 孔 底 呈 点 状 。以 100% 凝 集 的 病 毒 最 大 稀 释 度 为 该 病 毒 血 凝 价 ， 即 为 一 个 凝 集 单 位 。 从 表 4-1 看 出 ，该 新 城 疫 病 毒 液 的 血 凝 价 为 1:128， 则 l:128 为 1 个 血 凝 单 位 ， 1:64、 l:32 分 别 为 2、 4 个血 凝 单 位 ， 或 将 128/4=32， 即 1:32 稀 释 的 病 毒 液 为 4 个 血 凝 单

48、位 。(二 ) 血 球 凝 集 抑 制 (HI)试 验 1. 根 据 HA 试 验 结 果 ， 确 定 病 毒 的 血 凝 价 ， 配 制 出 4 个 血 凝 单 位 的 病 毒 液 。2. 在 96 孔 微 量 反 应 板 上 进 行 ， 用 固 定 病 毒 稀 释 血 清 的 方 法 ， 自 第 1 孔 至 第 11 孔 各 加50L 生 理 盐 水 。3. 第 孔 加 被 检 鸡 血 清 50L， 吹 吸 混 合 均 匀 ， 吸 50L 至 第 2 孔 ， 依 此 倍 比 稀 释 至 第10 孔 ， 吸 弃 50L， 稀 释 度 分 别 为 ： 1: 、 1:4、 1:8 ； 第 12 孔 加 新 城 疫 阳 性 血 清50L， 作 为 血 清 对 照 。4. 自 第 1 孔 至 12 孔 各 加 50L 4 个 血 凝 单 位 的 新 城 疫 病 毒 液 ， 其 中 第 11 孔 为 4 单 位新 城 疫 病 毒 液 对 照 ， 振 荡 混 合 均 匀 ， 置 室 温 中 作 用 10min 。5. 自 第 l 孔 至 12 孔 各 加 0.5% 鸡 红 细 胞 悬 液 50L， 振 荡 混 合 均 匀 ， 室 温 下 静 置 后 观察 结