免疫学实验.doc

1、实 验 一 凝 集 试 验颗 粒 性 抗 原 (细 菌 、 螺 旋 体 、 红 细 胞 等 )与 相 应 抗 体 结 合 后 ， 在 有 适 量 电 解 质 存 在下 ， 抗 原 颗 粒 可 相 互 凝 集 成 肉 眼 可 见 的 凝 集 块 ， 称 为 凝 集 反 应 (Agglutination reaction)或凝 集 试 验 。 参 与 凝 集 反 应 的 抗 原 称 为 凝 集 原 （ Agglutinogen） ， 抗 体 称 为 凝 集 素（ Agglutinin） 。细 菌 或 其 它 凝 集 原 都 带 有 相 同 的 负 电 荷 ， 在 悬 液 中 相 互 排 斥 而 呈

2、 现 均 匀 的 分 散 状态 。 抗 原 与 相 应 抗 体 相 遇 后 可 以 发 生 特 异 性 结 合 ， 形 成 抗 原 抗 体 复 合 物 ， 降 低 了 抗 原 分子 间 的 静 电 排 斥 力 ， 此 时 已 有 凝 集 的 趋 向 ， 在 电 解 质 （ 如 生 理 盐 水 ） 参 与 下 ， 由 于 离 子的 作 用 ， 中 和 了 抗 原 抗 体 复 合 物 外 面 的 大 部 分 电 荷 ， 使 之 失 去 了 彼 此 间 的 静 电 排 斥 力 ，分 子 间 相 互 吸 引 ， 凝 集 成 大 的 絮 片 或 颗 粒 ， 出 现 了 肉 眼 可 见 的 凝 集 反 应

3、 。 根 据 是 否 出 现凝 集 反 应 及 其 程 度 ， 对 待 测 抗 原 或 待 测 抗 体 进 行 定 性 、 定 量 测 定 。凝 集 反 应 包 括 直 接 凝 集 反 应 和 间 接 凝 集 反 应 两 大 类 ， 本 实 验 主 要 介 绍 直 接 凝 集 反 应 。目 的 要 求 1. 掌 握 平 板 凝 集 试 验 和 试 管 凝 集 试 验 的 操 作 方 法 。2. 掌 握 凝 集 试 验 的 结 果 判 定 及 判 定 标 准 。3. 熟 悉 平 板 凝 集 试 验 和 试 管 凝 集 试 验 所 需 材 料 和 试 剂 。材 料 与 试 剂 1. 玻 板 ， 载

4、 玻 片 ， 试 管 （ 1cm x 8cm） ， 试 管 架 ， 刻 度 吸 管 ， 滴 管 ， 微 量 可 调 加 样器 ， 滴 头 （ tip 头 ） ， 牙 签 或 火 柴 棒 ， 记 号 笔 。2. 灭 菌 的 生 理 盐 水 ， 灭 菌 的 0.5%石 炭 酸 生 理 盐 水 。3. 布 氏 杆 菌 病 试 管 凝 集 抗 原 ， 布 氏 杆 菌 病 平 板 凝 集 抗 原 ， 布 氏 杆 菌 病 虎 红 平 板 凝集 抗 原 ， 布 氏 杆 菌 病 阳 性 血 清 ， 布 氏 杆 菌 病 阴 性 血 清 ， 被 检 血 清 （ 牛 、 羊 或 猪 ） 。4. 鸡 白 痢 平 板

5、凝 集 抗 原 ， 鸡 白 痢 阳 性 血 清 ， 鸡 白 痢 阴 性 血 清 ， 被 检 鸡 血 清 。实 验 内 容 及 操 作 方 法 （ 一 ） 试 管 凝 集 试 验以 牛 布 氏 杆 菌 病 试 管 凝 集 试 验 为 例 。1. 试 管 准 备 ： 每 份 血 清 用 试 管 4 支 ， 另 取 3 支 试 管 作 为 对 照 ， 作 好 标 记 ， 置 试管 架 上 。 如 被 检 血 清 有 多 份 ， 对 照 只 需 做 1 份 。2. 被 检 血 清 稀 释 ： 第 1 管 加 入 2.3 ml 0.5% 石 炭 酸 生 理 盐 水 ， 第 2、 3、 4 管 加入 0.

6、5 ml 0.5% 石 炭 酸 生 理 盐 水 ； 然 后 用 加 样 器 或 刻 度 吸 管 吸 取 被 检 血 清 0.2 ml ，加 入 第 1 管 中 ， 反 复 吹 吸 5 次 混 匀 ， 吸 取 1.5 ml 弃 之 ， 再 吸 取 0.5 ml 加 入 第 2 管中 ， 混 匀 后 吸 取 0.5 ml 加 入 第 3 管 ， 依 此 类 推 至 第 4 管 ， 混 匀 后 吸 弃 0.5 ml （ 见表 1-1） 。 该 被 检 血 清 的 稀 释 度 分 别 是 1:12.5、 1:25、 1:50、 1:100。3. 对 照 管 制 作 ： 第 5 管 中 加 0.5% 石

7、 炭 酸 生 理 盐 水 0.5 ml ， 第 6 管 加 1:25 稀释 的 布 氏 杆 菌 病 阳 性 血 清 0.5 ml ， 第 7 管 加 1:25 稀 释 的 布 氏 杆 菌 病 阴 性 血 清 0.5 ml 。4. 加 抗 原 ： 将 布 氏 杆 菌 病 试 管 凝 集 抗 原 用 0.5% 石 炭 酸 生 理 盐 水 作 1:20 稀 释 ，每 支 试 管 加 0.5 ml 。表 1-1 布 氏 杆 菌 病 试 管 凝 集 试 验 术 式 表 （ 单 位 ： ml）试 管 号 1 2 3 4 5 6 7对 照 管最终血清稀释度 1：25 1：50 1：100 1：200 阳性血

8、清 阴性血清抗 原1：25 1：250.5%石炭酸生理盐水 2.3 0.5 0.5 0.5 0.5被检血清 0.2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5抗原(1：20) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5弃 1.5 弃 0.55. 感 作 （ 反 应 ） ： 7 支 试 管 加 完 抗 原 后 ， 充 分 混 匀 ， 置 于 37 温 箱 中 4-10h，取 出 后 置 室 温 18-24h（ 或 37 温 箱 12-14h， 取 出 后 置 室 温 2-4h； 或 37 温 箱 中22-24 h 取 出 ） ， 然 后 观 察 并 记 录 结 果 。6. 结 果 判 定

9、 ： 判 定 结 果 时 用 “+”表 示 反 应 的 强 度 。 根 据 各 管 中 上 清 液 的 透 明 度 、抗 原 被 凝 集 的 程 度 及 凝 集 块 的 形 状 ， 来 判 定 凝 集 反 应 的 程 度 。 ： 100 抗 原 凝 集 ， 上 清 液 完 全 透 明 ， 菌 体 完 全 被 凝 集 呈 伞 状 沉 于 管 底 ，振 荡 时 ， 沉 淀 物 呈 片 状 、 块 状 或 颗 粒 状 。 ： 75 抗 原 凝 集 ， 上 清 液 略 呈 混 浊 ， 菌 体 大 部 分 被 凝 集 沉 于 管 底 ， 振 荡 时情 况 如 上 。 （ 管 底 凝 集 物 与 100%

10、凝 集 时 相 同 ， 只 是 上 清 液 稍 浑 浊 ） 。 ： 50 抗 原 凝 集 ， 上 清 液 浑 浊 半 透 明 ， 管 底 有 中 等 量 的 凝 集 物 （ 管 底 有 明 显 的凝 集 ） 。 ： 25 抗 原 凝 集 ， 上 清 液 完 全 浑 浊 不 透 明 ， 管 底 有 少 量 凝 集 物 或 凝 集 的 痕 迹 。 ： 抗 原 完 全 未 凝 集 ， 上 清 液 完 全 浑 浊 不 透 明 ， 但 由 于 菌 体 的 自 然 下 沉 ， 在 管 底 中央 出 现 规 则 的 菌 体 自 沉 圆 点 ， 振 荡 后 立 即 散 开 呈 均 匀 混 浊 。7. 判 定

11、标 准 ： 能 使 50% 抗 原 凝 集 的 血 清 最 高 稀 释 度 称 为 该 血 清 的 凝 集 价 （ 或 称滴 度 ） 。牛 、 马 和 骆 驼 的 血 清 凝 集 价 大 于 或 等 于 1:100， 判 为 阳 性 ， 1:50 的 凝 集 价 判 为 疑似 反 应 （ 可 疑 ） ； 猪 、 绵 羊 、 山 羊 和 狗 的 血 清 凝 集 价 大 于 或 等 于 1:50， 判 为 阳 性 ，1:25 的 凝 集 价 判 为 疑 似 反 应 （ 可 疑 ） 。注 意 事 项 1. 实 验 时 必 须 设 抗 原 、 阳 性 血 清 及 阴 性 血 清 对 照 ， 以 避 免

12、 假 阳 性 、 假 阴 性 的 结 果 。2. 结 果 判 为 可 疑 时 ， 隔 2-3 周 后 采 血 重 做 。 阳 性 畜 群 ， 重 检 时 仍 为 可 疑 ， 可 判 为阳 性 。 对 同 群 中 既 无 临 床 症 状 又 无 凝 集 反 应 阳 性 者 ， 马 、 猪 重 检 仍 为 可 疑 ， 判 阴 性 ； 牛 、羊 重 检 仍 为 可 疑 者 ， 可 判 为 阳 性 ， 或 以 补 体 结 合 反 应 核 对 。（ 二 ） 布 氏 杆 菌 病 平 板 凝 集 试 验1. 加 血 清 ： 取 洁 净 玻 板 一 块 ， 用 蜡 笔 划 成 方 格 （ 4cm2） ， 并

13、注 明 被 检 血 清 号 码 ，以 100L 微 量 可 调 加 样 器 按 下 列 量 加 被 检 血 清 于 方 格 内 ， 第 l 格 80L、 第 2 格40L、 第 3 格 20L、 第 4 格 10L。 血 清 用 前 需 放 室 温 ， 使 其 温 度 达 20 左 右 。 每 一份 检 样 需 换 一 个 tip 头 。大 规 模 检 疫 时 ， 允 许 只 用 两 个 血 清 量 作 试 验 ， 牛 、 马 、 骆 驼 用 40L 和 20L ；猪 、 山 羊 、 绵 羊 、 狗 用 80L 和 40L。2. 加 抗 原 ： 每 格 加 布 氏 杆 菌 病 平 板 凝 集

14、抗 原 30L， 滴 在 血 清 附 近 ， 而 不 与 血 清接 触 。 从 血 清 量 最 少 的 一 格 起 ， 用 牙 签 将 血 清 与 抗 原 混 匀 ， 一 份 血 清 用 一 根 牙 签 。抗 原 用 前 摇 匀 ， 并 置 室 温 使 其 温 度 达 20 左 右 。3. 作 用 ： 混 和 完 毕 后 ， 将 玻 板 置 恒 温 箱 中 或 采 用 别 的 办 法 适 当 加 温 ， 使 温 度 达 到30 左 右 ， 3-5min 内 记 录 反 应 结 果 。4. 对 照 ： 每 次 试 验 须 用 标 准 阳 性 血 清 和 阴 性 血 清 以 及 生 理 盐 水 作

15、 对 照 。5. 结 果 判 定 ： 按 下 列 标 准 记 录 反 应 结 果 。 ： 出 现 大 的 凝 集 块 ， 液 体 完 全 透 明 ， 即 100% 凝 集 。 ： 有 明 显 凝 集 块 ， 液 体 几 乎 完 全 透 明 ， 即 75% 凝 集 。 ： 有 可 见 凝 集 块 ， 液 体 不 甚 透 明 ， 即 50% 凝 集 。 ： 液 体 混 浊 ， 有 小 的 颗 粒 状 物 ， 即 25% 凝 集 。 ： 液 体 均 匀 混 浊 ， 无 凝 集 现 象 。6. 平 板 凝 集 试 验 与 试 管 凝 集 试 验 的 关 系 见 表 1-2。表 1-2 平 板 凝 集

16、试 验 与 试 管 凝 集 试 验 的 关 系平 板 凝 集 80L 40L 20L 10L相 当 于 试 管 凝 集 1:25 1:50 1:100 1:2007. 判 定 标 准 ： 同 试 管 凝 集 试 验 。8. 注 意 ： 对 于 阳 性 及 可 疑 的 被 检 血 清 需 用 试 管 凝 集 试 验 进 行 验 证 。（ 三 ） 虎 红 平 板 凝 集 试 验这 种 试 验 是 快 速 平 板 凝 集 试 验 。 抗 原 是 布 氏 杆 菌 加 虎 红 制 成 。 虎 红 平 板 凝 集 试 验 可与 试 管 凝 集 试 验 及 补 体 结 合 试 验 效 果 相 比 ， 具 有

17、 操 作 简 单 、 快 速 、 特 异 性 强 的 优 点 。1. 被 检 血 清 和 布 氏 杆 菌 病 虎 红 平 板 凝 集 抗 原 各 30L 滴 于 玻 璃 板 的 方 格 内 ， 每 份血 清 各 用 一 支 牙 签 或 火 柴 棒 混 合 均 匀 。 在 室 温 （ 20 ） 4-10min 内 记 录 反 应 结 果 。 同时 以 阳 、 阴 性 血 清 作 对 照 。 2. 结 果 判 定 ： 在 阳 性 血 清 及 阴 性 血 清 试 验 结 果 正 确 的 前 提 下 ， 被 检 血 清 出 现 任 何程 度 的 凝 集 现 象 均 判 为 阳 性 ， 完 全 不 凝

18、集 的 判 为 阴 性 ， 无 可 疑 反 应 。3. 注 意 ： 抗 原 用 前 充 分 摇 匀 ， 抗 原 和 被 检 血 清 用 前 应 放 室 温 30-60min 后 再 进 行试 验 。（ 四 ） 鸡 白 痢 平 板 凝 集 试 验1. 被 检 鸡 血 清 和 鸡 白 痢 平 板 凝 集 抗 原 各 1 滴 （ 约 30L） 滴 于 玻 板 或 载 玻 片 上 ，用 牙 签 或 火 柴 棒 充 分 混 合 。2. 结 果 判 定 ： 在 室 温 （ 20 ） 下 ， 观 察 30-60s， 凝 集 者 为 阳 性 ， 不 凝 集 者 为 阴性 。思 考 题 1. 凝 集 反 应 的

19、 原 理 是 什 么 ?2. 哪 些 因 素 影 响 细 菌 凝 集 试 验 ?3. 凝 集 试 验 中 为 什 么 要 设 阳 性 、 阴 性 血 清 及 抗 原 对 照 ？实 验 二 病 毒 的 血 凝 及 血 凝 抑 制 试 验有 些 病 毒 具 有 凝 集 某 种 (些 )动 物 红 细 胞 的 能 力 ， 称 为 病 毒 的 血 凝 ， 利 用 这 种 特 性设 计 的 试 验 称 血 球 凝 集 (HA)试 验 ， 以 此 来 推 测 被 检 材 料 中 有 无 病 毒 存 在 ， 是 非 特 异 性的 ， 但 病 毒 的 凝 集 红 细 胞 的 能 力 可 被 相 应 的 特 异

20、 性 抗 体 所 抑 制 ， 即 血 球 凝 集 抑 制 (HI)试验 ， 具 有 特 异 性 。 通 过 HA-HI 试 验 ， 可 用 已 知 血 清 来 鉴 定 未 知 病 毒 ， 也 可 用 已 知 病 毒来 检 查 被 检 血 清 中 的 相 应 抗 体 和 滴 定 抗 体 的 含 量 。 目 的 要 求 掌 握 病 毒 HA 和 HI 试 验 的 原 理 和 基 本 操 作 方 法 ， 了 解 其 实 用 价 值 。材 料 与 试 剂 1. 96 孔 “U”形 或 “V”形 微 量 反 应 板 ， 50L 定 量 移 液 器 ， 滴 头 ， 微 型 振 荡 器 。2. 生 理 盐

21、水 ， 0.5% 鸡 红 细 胞 悬 液 。3. 新 城 疫 病 毒 液 （ 尿 囊 液 或 冻 干 疫 苗 液 ） ， 新 城 疫 阳 性 血 清 ， 被 检 鸡 血 清 。实 验 内 容 及 操 作 方 法 （ 一 ） 血 球 凝 集 (HA)试 验 1. 在 96 孔 微 量 反 应 板 上 进 行 ， 自 左 至 右 各 孔 加 50L 生 理 盐 水 。2. 于 左 侧 第 1 孔 加 50L 病 毒 液 （ 尿 囊 液 或 冻 干 疫 苗 液 ） ， 混 合 均 匀 后 ， 吸50L 至 第 2 孔 ， 依 次 倍 比 稀 释 至 第 11 孔 ， 吸 弃 50L； 第 12 孔

22、为 红 细 胞 对 照 。3. 自 右 至 左 依 次 向 各 孔 加 入 0.5% 鸡 红 细 胞 悬 液 50L， 在 振 荡 器 上 振 荡 ， 室 温下 静 置 后 观 察 结 果 （ 表 4-1） 。表 4-1 病 毒 血 凝 试 验 的 操 作 方 法 （ 单 位 ： L）孔 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12病毒稀释度 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照生理盐水 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50病毒液 50 50 50 50 50 5

23、0 50 50 50 50 50 0.5%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50弃 50结果观察 + + + + + + + + + + - -4. 结 果 判 定 ： 从 静 置 后 10 min 开 始 观 察 结 果 ， 待 对 照 孔 红 细 胞 已 沉 淀 即 可 进 行结 果 观 察 。 红 细 胞 全 部 凝 集 ， 沉 于 孔 底 ， 平 铺 呈 网 状 ， 即 为 100% 凝 集 （ +） ， 不凝 集 者 （ -） 红 细 胞 沉 于 孔 底 呈 点 状 。以 100% 凝 集 的 病 毒 最 大 稀 释 度 为 该 病 毒 血 凝

24、 价 ， 即 为 一 个 凝 集 单 位 。 从 表 4-1看 出 ， 该 新 城 疫 病 毒 液 的 血 凝 价 为 1:128， 则 l:128 为 1 个 血 凝 单 位 ， 1:64、 l:32分 别 为 2、 4 个 血 凝 单 位 ， 或 将 128/4=32， 即 1:32 稀 释 的 病 毒 液 为 4 个 血 凝 单 位 。(二 ) 血 球 凝 集 抑 制 (HI)试 验 1. 根 据 HA 试 验 结 果 ， 确 定 病 毒 的 血 凝 价 ， 配 制 出 4 个 血 凝 单 位 的 病 毒 液 。2. 在 96 孔 微 量 反 应 板 上 进 行 ， 用 固 定 病 毒

25、稀 释 血 清 的 方 法 ， 自 第 1 孔 至 第 11孔 各 加 50L 生 理 盐 水 。3. 第 孔 加 被 检 鸡 血 清 50L， 吹 吸 混 合 均 匀 ， 吸 50L 至 第 2 孔 ， 依 此 倍 比 稀释 至 第 10 孔 ， 吸 弃 50L， 稀 释 度 分 别 为 ： 1: 、 1:4、 1:8 ； 第 12 孔 加 新 城疫 阳 性 血 清 50L， 作 为 血 清 对 照 。4. 自 第 1 孔 至 12 孔 各 加 50L 4 个 血 凝 单 位 的 新 城 疫 病 毒 液 ， 其 中 第 11 孔 为4 单 位 新 城 疫 病 毒 液 对 照 ， 振 荡 混

26、合 均 匀 ， 置 室 温 中 作 用 10min 。5. 自 第 l 孔 至 12 孔 各 加 0.5% 鸡 红 细 胞 悬 液 50L， 振 荡 混 合 均 匀 ， 室 温 下 静 置后 观 察 结 果 （ 表 4-2） 。表 4-2 病 毒 血 凝 抑 制 试 验 的 操 作 方 法 （ 单 位 ： L）孔 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12血清稀释度 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024病毒对照血清对照生理盐水50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50被检鸡血清50 50 50

27、 50 50 50 50 50 50 50 504 单位病毒50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50室温中静置 10 min0.5%红 细胞50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50弃去50 结果观察- - - - - - + + + + + -6. 结 果 判 定 ： 待 病 毒 对 照 孔 （ 第 11 孔 ） 出 现 红 细 胞 100%凝 集 （ +） ， 而 血 清对 照 孔 （ 第 12 孔 ） 为 完 全 不 凝 集 （ -） 时 ， 即 可 进 行 结 果 观 察 。以 100 抑 制 凝 集 （ 完 全 不 凝 集 ）

28、 的 被 检 血 清 最 大 稀 释 度 为 该 血 清 的 血 凝 抑 制 效 价 ，即 HI 效 价 。 凡 被 已 知 新 城 疫 阳 性 血 清 抑 制 血 凝 者 ， 该 病 毒 为 新 城 疫 病 毒 。从 表 4-2 看 出 ， 该 血 清 的 HI 效 价 为 1:64， 用 以 2 为 底 的 负 对 数 (-log2)表 示 ，即 6log2。附 录1. 阿 氏 液 （ Alsever） ： 即 红 细 胞 保 养 液枸 橼 酸 钠 （ 5H2O） 0.80g枸 橼 酸 （ H2O） 0.055g葡 萄 糖 2.05g氯 化 钠 0.42g双 蒸 水 加 至 100 ml

29、将 以 上 试 剂 加 热 溶 解 于 双 蒸 水 中 ， 调 整 pH 至 6.8， 115 灭 菌 10min,4 保 存 备用 。2. 0.5% 鸡 红 细 胞 制 备 方 法先 用 灭 菌 注 射 器 吸 取 3.8% 枸 橼 酸 钠 溶 液 (其 量 为 所 需 血 量 的 1 5)， 从 鸡 翅 静 脉或 心 脏 采 血 至 需 要 血 量 ， 置 灭 菌 离 心 管 内 ， 加 灭 菌 生 理 盐 水 为 抗 凝 血 的 2 倍 ， 以2000r/min 离 心 10min， 弃 上 清 液 ， 再 加 生 理 盐 水 悬 浮 血 球 ， 同 上 法 离 心 沉 淀 ， 如 此

30、将红 细 胞 洗 涤 三 次 ， 最 后 根 据 所 需 用 量 ， 用 灭 菌 生 理 盐 水 配 成 0.5% 鸡 红 细 胞 悬 液 。3. 96 孔 微 量 反 应 板 的 清 洗将 浸 泡 有 75% 乙 醇 的 棉 签 放 入 微 量 反 应 板 的 每 个 孔 内 旋 转 ， 用 自 来 水 冲 洗 反 应 板5 次 ， 再 用 蒸 馏 水 冲 洗 3 次 以 上 ， 置 37 温 箱 中 干 燥 。思 考 题 1. HA 和 HI 试 验 的 原 理 是 什 么 ？2. HI 试 验 是 不 是 特 异 的 抗 原 抗 体 反 应 ， 为 什 么 ?3. HA 和 HI 试 验 有 何 实 际 应 用 意 义 ？