1、免疫学实验整理 一、凝集试验、吞噬试验 （ 一）凝集试验 1、直接凝集反应（ ABO 血型鉴定） 2、间接凝集反应（类风湿因子测定） 3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验 （二）吞噬试验（示教） 1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬） 2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬） 名解： 1.免疫学检测技术： 利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。 如凝集反应可用于检测抗原抗体，吞噬十堰可用于检测免疫细胞等。 2.凝集反应（ agglutination reaction） :在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集
2、块，称为凝集反应。 3.直接凝集反应（ direct agglutination reaction） :细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。 4.间接 凝集反应（ indirect agglutination reaction）：将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量 的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。 5.协同凝集实验（ coagglutination）：利用金黄色葡萄球菌 A 蛋白（ SPA）能与人和多种哺乳动物 IgG 的 Fc 段结合而不影响其
3、Fab 段功能的特性，将已知的特异性抗体吸附于金黄色葡萄球菌上，与相应的抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验。 6.滴度（ titer）、效价： The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (+) is called the titer. 实 验及注意点： 1、 检测抗原抗体的基本原则：根据抗原抗体结合反应的高度特异性，用已知抗体（抗原）检测未知抗原（抗体），有现象则说明有相应抗原，无现象则无相应抗原。 2、 直接凝集反应（ ABO 血型鉴定） ：若加 A 抗体出现凝集说明血清中有 A 抗原，为 A 型血。凝集时
4、红细胞凝集成块。 3、 间接凝集反应（类风湿因子测定） ： 人丙种球蛋白吸附在红细胞上成为致敏红细胞，再用致敏红细胞检测类风湿关节炎患者血清中的类风湿因子（抗变性 IgG 抗体）。此实验中以“ +”的血清最高稀释度作为试验效价，效价 1:40 则阳性。 4、 金黄色葡萄球菌协同凝集试验 ： 1 2 3 致敏金葡菌 +脑脊液 致敏金葡菌 +生理盐水 未致敏金葡菌 +脑脊液 凝集（脑脊液中 A 群脑膜炎球菌阳性） 不凝集 不凝集 5、 中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬） ； 巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬） 6、 吞噬百分率 =（吞噬的中性粒细胞数） /（观察记录的中性粒总数（ 100） 100% 7、
5、吞噬指数 =（被吞噬的细菌总数） /（观察记录的吞噬细胞总数（ 100）【书上和老师课件上有出入，此为书上版】 二、沉淀试验、溶血反应 （一）沉淀反应 1、单向琼脂扩散试验（示教） 2、双向琼脂扩散试验 3、对流免疫电泳试验 （二）补体参与的免疫反应 1、溶血反应 2、补体结合试验（原理） 名解： 1.沉淀反应（ precipitation）：可溶性抗原如血清、毒素、细菌浸出液等与相应抗体结合，当两者比例合适、并有适量电解质存在时，形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线，称为沉淀反应。 单项琼脂扩散实验（未做） ：定量实验。 将一定量抗体和琼脂混合倾注于玻璃板上，凝固后在琼脂层中打孔，再将抗原加入孔中。
6、 孔中抗原向四周扩散，在抗原与抗体比例合适处呈现白色沉淀环，沉淀环直径大 小与抗原浓度成正比。 2.双向琼脂扩散实验：定性或半定量实验。将可溶性抗原和抗体分别加入到琼脂板相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如果抗原与抗体相对应，则在两者比例合适处形成白色沉淀线。根据沉淀线位置、形状等可对抗原或抗体做出定性分析。 3.对流免疫电泳：蛋白质抗原在碱性缓冲液中带负电荷，在电泳时从负极向正极移动。抗体在碱性缓冲液中只带微弱的负电荷，而且其分子量较大，电泳力较小，在琼脂电渗力作用下反而由正极向负极移动，这样就使抗原和抗体定向对流，在两孔间相遇时发生反应，并在比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线 。这种将双向
7、琼脂扩散和电泳技术结合在一起的方法称为对流免疫电泳。由于抗原、抗体在电场中定向移动，限制了抗原抗体的多向自由扩散，加快了抗原抗体的移动速度，因而提高了试验的敏感度，同时也缩短了试验时间，故可用于快速诊断。 4.电渗作用：电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。由于琼脂中 SO42-带负电荷，其周围的水就带正电荷，向负极移动，这种现象称电渗作用，水向负极移动产生的力为电渗力。因此在电泳的时候既有电泳力，又有电渗力。电渗力会加快带正电的物质向负极移动，但是会拮抗带负电物质向正极移动，甚至使其反而向 负极移动。 5.溶血反应：将红细胞多次注射于动物（如将绵羊红细胞多次免疫家兔）可使之产生相应的抗
8、体（溶血素），这种抗体与红细胞结合，在有电解质存在时可发生凝集现象，若同时有补体存在，则补体被激活，红细胞被破坏溶解，这种现象称为溶血反应。 6.补体结合试验：有一种补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。（未做试验，熟悉原理） 实验及注意点： 1.双向扩散时沉淀线的几种情况： （ 1） 抗原与抗体浓度相等，沉淀线在两孔之间呈直线 （ 2） 有一方浓度低则沉淀线靠近浓度低的一方（扩散慢） （ 3） 在三角形孔中 若两孔内抗原相同，与同一相应抗体反应，则两沉淀顶端相联；若两孔内抗原不同，与两种相应抗体反应，则两沉淀线相交；若两孔内抗原除有相同成分外又有不同成分，抗体孔内有各相
9、应的抗体，则形成的沉淀线相切。 2.溶血实验 （图表见书）： （ 1）红细胞溶解时细胞浑浊液体变红色透明。红细胞、溶血素、补体存在时可以发生溶血。 （ 2）红细胞和溶血素，不溶血，离心后剩余沉淀物再加入补体，发生溶血，说明溶血素可以与红细胞结合，进而在补体存在条件下发生溶血。 （ 3）红细胞和补体，不溶血，离心后剩余沉淀再加入溶血素，还是不溶 血，说明补体不能结合红细胞。 三、免疫标记技术、细胞免疫功能测定、豚鼠过敏试验 （一）免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验（双抗体夹心法） 2、斑点免疫层析试验 （二）免疫细胞功能测定 1、 E 玫瑰花环试验（示教） 2、淋巴细胞转化试验（示教） （三）豚
10、鼠过敏试验（录像） 免疫标记技术 1.原理： 酶免疫技术是一种把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用结合起来的方法。将酶与抗体或抗原用交联剂连接起来，此种酶标记抗体或抗原可与组织内的或 固相载体上的相应抗原或抗体发生特异性反应，加入相应的酶底物时，底物被酶催化生成有色产物，根据成色深浅判定待测抗原或抗体的浓度与活性。 酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两类，前者用于组织切片上抗原的定性和定位。后者用于标本中抗原或抗体的测定，最常用的方法是酶联免疫吸附试验。 2.酶联免疫吸附试验（ ELISA）现象： 从左向右看，反应孔 1、 2（加入样本）和反应孔 3、 4（加入阳性对照）均呈棕黄
11、色，而反应孔 5、 6（加入阴性对照）呈无色。 3结论： 试验结果为阳性，待检标本中含有乙肝病毒表面抗原。 斑点免疫层析试验（ DICA） 1.原理： 斑点免疫层析试验以硝酸纤维素膜为载体，将多个试剂组合在一个约 6mm*70mm的试纸条上，成为单一试剂条，试剂条上端（ A）和下端（ B）分别为粘贴吸水材料，金标抗体干片粘贴在近下端（ C）处，紧贴其上为硝酸纤维膜条。硝酸纤维膜条上有两个反应区域，测试区（ T）包被有特异抗体，参照区（ R）包被有抗小鼠 IgG。测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经 C 处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条移动。若标
12、本中有待测特异性抗原，则与免疫复合物之 抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所捕获，在膜上显出红色反应线条（ T）。过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相抗小鼠 IgG 结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠 IgG），而显出红色质控线条（ R）。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。 2.现象： 上图中上纸条为一条红线，下纸条出现两条红线。 3.结论： 一条红线为阴性结果，说明待测液体中无 HCG，而两条红线为阳性结果，说明待测液体中有 HCG。 E 玫瑰花环试验 1.原理： 人外周血 T 淋巴细胞表面具有绵羊红细胞（ SRBC）受体，在体外一定条件下，当 T细胞与
13、SRBC 结合时，可形成以 T 细胞为中心，四周环绕 SRBC 的花环。 E 花环的形成是 T 细胞独特的标志。 E 花环形成试验最常用的是总 E 花环试验和活性 E 花环试验。总 E 花环试验代表被检标本中 T 淋巴细胞的总数和百分率；而活性 E 花环试验反映的是对 SRBC 具有高度亲和力的 T 淋巴细胞亚群，该亚群 T 细胞与 T 细胞的体内外功能活性有密切关系，在一定程度上反映机体细胞免疫功能的状态。 2.现象： 可见以 T 淋巴细胞为中心，四周环绕 SRBC 的花环。 淋巴细胞 转化试验 1原理：将人外周血或分离的淋巴细胞与 PHA 共同培养一定时间后，取培养细胞涂片染色，镜下计数转
14、化的淋巴母细胞数，计算其转化率，转化率高低可反映人体细胞免疫功能的水平。 2.现象： 可见淋巴母细胞：体积明显增大，核膜清晰，胞核增大，多偏一侧，核染色质疏松呈细网状。胞浆丰富，嗜碱性，有伪足样突出，有时可见小空泡。 核分裂相细胞：可见有丝分裂，可见许多对成堆或散在的染色体。 过渡型淋巴细胞：具有淋巴母细胞的某些特征。核质疏松，可见核仁，胞浆增多，嗜碱性强。 豚鼠过敏试验（属型超敏反应，也称速发型超敏反应） 四、小鼠脾 NK 细胞活性测定（ MTT 比色法） 1.实验原理： 将 NK 细胞和靶细胞共同培养， NK 细胞可杀伤靶细胞，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性黄色的 MTT 还原成蓝紫
15、色的 Formazan 结晶，并沉积在细胞里。而死细胞无此功能，通过比色检测可以检测培养物中活细胞的数量，从而计算 NK 细胞杀伤靶细胞的能力。 2.实验方法： 2.1 NK 细胞制备：小鼠脾细胞分离 （ 1） 脱臼法处死小鼠，酒精棉球消毒皮肤，取脾，放入滤网，置于平皿中，在滤网脾脏处加入 3ml Hanks 液 ; （ 2） 用试管底部碾磨脾脏，制成脾细胞悬液， 200 目滤网制成单细胞悬液 ; 离心（ 1500 转 /分 5min），弃去上清 ; （ 3） 加入 Hanks 液 3ml ，重悬细胞， 1500 转 /分 5min，去上清，加入 1ml 1640 培养液，混匀细胞； （ 3）
16、 细胞计数：取细胞悬液 20 微升，加到含有 780 微升白细胞稀释液的 Eppendorf 管中，混匀，取适量细胞悬液（约 15ul），加入计数板中。在显微镜下计数，计算细胞数量。 （ 4） 根据细胞数量，用 1640 完全培养基配成 2 106/ml 浓度的细胞悬液。 2.2 靶细胞的制备： 取对数生长期 YAC-1 细胞， Hanks 液洗涤 2 次，计数，调整至 2 105/ml。 2.3 细胞毒试验（ 96 培养板）：每组做 3 个复孔 2.4 孵育 ： 二氧化碳培养箱孵育 2 小时；加 10 l MTT，继续孵育 2 小时。 2.5 测 OD 值 ： 吸取上清约 150ul，加 150 l 二甲亚砜，振荡 10min，测 OD 值。 3.实验结果： 注：前两次实验根据书本整理，后两次主要为实验报告。大家凑合着看吧，若有差错欢迎指正 祝满绩！
