1、实验九 差示分光光度法测定维生素 B1 片的含量一、实验目的1掌握差示分光光度法的基本原理。2熟悉标准曲线定量的操作方法。二、实验原理 （一）差示分光光度法（简称A 法） ，它保留了通常的分光光度法简便、快捷、直接读数的优点，又无需事先分离，并能消除干扰。方法：取两份相等的供试液，分别制成两种不同的化学环境（如在其一中加酸或碱，改变 pH 或在其一中加能与供试品发生某种化学反应的试剂） ，然后将它们稀释至同样浓度后，分置于样品池和参比池中，于适当波长处，测定吸光度的差值（A） 。应用条件：供试品在不同的化学环境中以不同的分子形式存在，它们的吸收光谱有显著的差异；干扰物的吸收不受测定时化学环境的
2、影响，光谱行为不变。定量依据：设 x、y 分别代表在两种不同的化学环境中供试品的存在形式，它们在测定波长处的吸光度以 Ax 、 Ay 表示，背景和干扰的吸收度以 AZ 表示，A Z 不受测定时化学环境改变的影响。根据吸光度加和性原则：即在供试液的一定浓度范围内A 值与其浓度 C 呈线性关系，并消除了 AZ 的干扰，可用标准曲线法或对照法定量。（二）维生素 B1 片的测定维生素 B1 分子中具有共轭双键结构，在紫外区有吸收，其紫外吸收随溶液 pH 的变化而变化。在 pH7 的磷酸盐缓冲液中具有两个吸收峰，在 232233nm 处， =345；在%1cmE266nm 处， =255。在 pH2 时
3、，最大吸收在 246nm 处， =425。可用于维生素 B1%1cmE1cm片的差示分光光度法的测定。三、实验方法(一) 测定波长的选择精密称取维生素 B1100mg，用水溶解并稀释成 100ml，精密量取 2ml 二份，分别用缓冲液(pH 7.0)和盐酸液 (pH 2.0)稀释成 100ml，以相应溶剂为空白，测定紫外吸收光谱。再将前者放于参比池，后者放于样品池，绘制差示吸收光谱(见图 11)。差示光谱图表明在247nm 处有最大差示吸收值(A)，确定 247nm 为测定波长。(二) 标准曲线绘制精密称取干燥至恒重的维生素 B1100mg，置 100ml 量瓶中，用水溶解并稀释至刻度,摇匀，
4、作为贮备液。精密量取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml 贮备液各二份，分别置 100ml 量瓶中，一份用缓冲液稀释至刻度；另一份用盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。取上述五组浓度相同，pH 不同的溶液，在 247nm 处分别测定差示吸收值(A)。以浓度 C 为横坐标，以差示吸收值A 为纵坐标绘制标准曲线或进行回归，求得回归方程和相关系数。(三) 样品测定取本品 20 片，精密称定，研细。精密称取适量粉末(约相当于维生素 B1 50mg)，置 50ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液 2ml 二份，分别置 100ml 量瓶中，分别用缓冲液和盐酸液稀释至刻度，摇匀。将前者置参比池中，后者置样品池中，在 247nm 波长处测定差示吸收值。由标准曲线求得维生素 B1，浓度，计算维生素 Bl 片的标示量。本品含维生素 Bl(C12H17ClN4OSHCl)应为标示量的 90.0110.0。四、注意事项 1由于仪器波长可能存在差异，所给测定波长仅供参考，可照“测定波长的选择”项下自行测定。2测定标准系列各细溶液的A 时，一定要遵循先稀后浓的原则，尽可能消除测定误差。五、思考题1差示分光光度法的优点是什么？2差示分光光度法是怎样消除干扰的？
