1、饲料粗蛋白测定的测定方法Method for the determination of crude protein in feedstuffs本标准参照采用 ISO5983-1979动物饲料-氮含量的测定和粗蛋白含量计算 。1 主题内容与适用范围本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。2 引用标准GB 601 化学试剂 滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备3 原理凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收液吸收后，再用酸滴定。测出氮含量，将结果乘以换算系数 6.25，计算出粗
2、蛋白的含量。4 试剂4.1 硫酸（GB625）:化学纯，含量为 98%，无氮。4.2 混合催化剂0.4g 硫酸铜，5 个结晶水（GB665） ， 6g 硫酸钾（HG3-920）或硫酸钠（HG3-908） ，均为化学纯，磨碎混匀。4.3 氢氧化钠（GB629）：化学纯，40%水溶液（M/V） 。4.4 硼酸（GB628） ，化学纯，2%水溶液（M/V） 。4.5 混合指示剂溶液甲基红（HG3-958）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG3-1220）0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。4.6 盐酸标准溶液，c(HCl)=0.1mol/L、0.02mol/L 配制如下：移取 8
3、.3mL 盐酸(分析纯)，于 1000mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。此溶液为 c(HCl)=0.1mol/L。移取 1.67mL 盐酸(分析纯)，于 1000mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。此溶液为 c(HCl)=0.02mol/L。4.7 蔗糖，分析纯。4.8 硫酸铵，分析纯，干燥。4.9 硼酸吸收液1%硼酸水溶液 1000mL，加入 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液 10mL， 0.1% 甲基红乙醇溶液 7mL， 4%氢氧化钠水溶液 0.5mL，混合，置阴凉处保存期为一个月(全自动程序用)。5 仪器设备5.1 实验室用样品粉碎机或研钵；5.2 分样筛，孔径 0.45mm(40 目)
4、；5.3 分析天平，感量 0.0001g ；5.4 消煮炉或电炉；5.5 滴定管，酸式，10、25mL ；5.6 凯氏烧瓶，250mL ；5.7 凯氏蒸馏装置，常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；5.8 锥形瓶，150、250mL ；5.9 容量瓶，100mL ；5.10 消煮管，250mL ；5.11 定氮仪，以凯氏原理制造的各类型半自动，全自动蛋白质测定仪。6 试样的选取和制备选取具有代表性的试样用四分法缩减至 200g，粉碎后全部通过 0.45mm（40 目筛） ，装于密封容器中， 防止试样成分的变化。7 分析步骤7.1 仲裁法7.1.1 试样的消煮称取试料 0.51g(含氮量 580m
5、g)准确至 0.0002g，放入凯氏烧瓶（5.6）中，加入 6.4g 混合催化剂（4.2） ，与试样混合均匀，再加入 12mL 硫酸（4.1）和2 粒玻璃珠，将凯氏烧瓶（5.6）置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力(360410)直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少 2h。7.1.2 氨的蒸馏7.1.2.1 常量蒸馏法将试料消煮液（7.1.1）冷却，加入 60100mL 蒸馏水，摇匀，冷却。将蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有 25mL 硼酸吸收液和 2 滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶中加入 50mL 氢氧化钠溶液（4.3） ，轻轻摇动凯
6、氏烧瓶（5.6） ，使液溶混匀后再加热蒸馏，直至流出液体积为100mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏 12min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内， 然后停止蒸馏。7.1.2.2 半微量蒸馏法将试样消煮液（7.1.1）冷却，加入 20mL 蒸馏水，转入 100mL 容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。将半微量蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有 20mL 硼酸吸收液和 2 滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶内。蒸汽发生器（5.7）的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色， 否则需补加硫酸。准确移取试样分解液 1020mL
7、注入蒸馏装置（5.7）的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL 氢氧化钠溶液（4.3） ，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏 4min，降下锥形瓶（5.8） ，使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏 1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。注：7.1.2.1 和 7.1.2.2 蒸馏法测定结果相近，可任选一种。7.1.2.3 蒸馏步骤的检验准确称取 0.2g 硫酸铵（4.8） ，代替试料，按 7.1.2 或 7.2.2 步骤进行操作，测得硫酸铵的质量分数为 21.19 0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴
8、定各步骤是否正确。7.1.3 滴定用 7.1.2.1 或 7.1.2.2 法蒸馏后的吸收液立即用 0.1mol/L （4.6.1）或0.02mol/L（4.6.2）盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。7.2 推荐法7.2.1 试样的消煮称取 0.51g 试料(含氮量 580mg)准确至 0.0002g，放入消化管中，加 2 片消化片(仪器自备)或 6.4g 混合催化剂，12mL 硫酸（4.1） ，于 420下在消煮炉上消化 1h。取出放凉后加入 30mL 蒸馏水。7.2.2 氨的蒸馏采用全自动定氮仪（5.11）时，按仪器本身常量程序进行测定。采用半自动定氮仪（5.11）时，将带消化
9、液的管子插在蒸馏装置上，以 25mL 硼酸溶液为吸收液，加入 2 滴混合指示剂（4.5） ，蒸馏装置的（5.7）的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入 50mL 氢氧化钠溶液进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到 100mL 时为宜。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。7.2.3 滴定用 0.1mol/L 标准盐酸溶液（4.6.1）滴定吸收液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。8 空白测定称取 0.5g 蔗糖，代替试样，按第七章进行空白测定，消耗 0.1mol/L 盐酸标准溶液（4.6.1）的体积不得超过 0.2mL。消耗 0.02mol/L 盐酸标准溶液（4
10、.6.2）体积不得超过 0.3mL。9 分析结果的表述9.1 计算见下式： 式中：V 2滴定试样所需标准溶液体积，mL；V1滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL； C盐酸标准溶液浓度，mol/L； m试样质量，g； V试样分解液总体积，mL； V试样分解液蒸馏用体积，mL； 0.0140 每毫克当量氮的克数；6.25氮换算成蛋白质的平均系数。9.2 重复性每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。当粗蛋白质含量在 25以上时，允许相对偏差为 1。当粗蛋白质含量在 1025之间时，允许相对偏差为 2。当粗蛋白质含量在 10以下时，允许相对偏差为 3。参考文献GB/T 643294 饲料中粗蛋白测定方法1025.604.C)(%)12 Vm（粗 蛋 白 质
