1、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量,掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原理与方法。 熟练分光光度计的使用和操作方法。,一、实验目的。,考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕红色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质浓度成正比,实验原理,器材。可见分光光度计、试管、试管架、刻度移液管、移液枪 试剂。 水 考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G250 100，加95乙醇100ml，溶解后加85H， 100 ml，加水稀释至1000ml
2、，存于棕色瓶。 蛋白质标准溶液 准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置1mg/ml标准溶液。,三、实验器材与试剂,四、实验步骤,标准曲线的制作 取试管6只，按下表进行编号并加入试剂，充分摇匀。,试管编号,试剂,每支试管加入5ml考马斯亮蓝试剂,振荡混合后放置5分钟,于595nm测定吸光度,A595为纵坐标、标准蛋白含量横坐标 绘制标准曲线,样品提取液中蛋白质含量的测定,取3支试管，各吸未知浓度 蛋白液0.1ml，分别加考 马斯亮蓝试剂5ml,振荡混合放置5分钟,以制作标准曲线的1号试管 做空白对照，595nm测吸光度,据所测A595值，于标准曲线 上查出相当标准蛋白的量，取 三重复样品蛋白含量均值,结果计算 样品蛋白质含量 ug/ml,五、注意事项 待测液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在100800gml为宜。 比色测定时，考马斯亮蓝易吸附在比色皿表面，对后续测定造成影响，因此测定结束后用无水乙醇清洗比色皿。,
