1、考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质浓度一、实验原理 双缩脲法（biuret 法）和 folin酚试剂法（lowry 法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976 年由 bradford 建立的考马斯亮兰法（bradford 法） ，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰 g-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax） ，由 465nm 变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为
2、，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在 595nm 下测定的吸光度值 A595，与蛋白质浓度成正比。bradford 法的突出优点是： 1. 灵敏度高，据估计比 lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达 1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 lowry 法要大的多。 2. 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在1 小时内保持稳定，且在 5 分钟至 20 分钟之间，
3、颜色的稳定性最好。因而完全不用像 lowry 法那样费时和严格地控制时间。 3. 干扰物质少。如干扰 lowry 法的 K+、Na+、Mg2+离子、tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta 等均不干扰此测定法此法的缺点是： 1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和 0.1n 的 naoh。 （如同 0.1n 的酸干扰 lowar
4、y 法一样） 。 3. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用 beer 定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。1、试剂：（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝 G250 100mg 溶于 50ml 95%乙醇，加入 100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至 1000ml, 滤纸过滤。最终试剂中含 0.01%（W/V）考马斯亮蓝 G250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。（2）标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，根据其纯度配制成 100 ug/ml 蛋白溶液2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器3、标准曲线的制作试管编号 0 1 2 3 4
5、5 6100ug/ml 标准蛋白（ml） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6蒸馏水 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5摇匀，1h 内以 0 号管为空白对照,在 595nm 处比色 以 A595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为 10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug） ，在坐标轴上绘制标准曲线。4、样品中蛋白质含量的测定另取两支干净的试管（做一重复） ，加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。注意事项：1、如果要求严格，最好在试剂加入后的 520min 内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。2、若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。3、不可使用石英比色皿（因不易洗去染色） ，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量 95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
