1、分光光度法介绍分光光度法是利用溶液中特定溶质的光吸收测定其浓度的方法，其基本原理是根据Lambert和 Beer 定律。一 Lambert 定律当一束平行单色光垂直照射于一均匀物质溶液时，溶液将吸收一部分光能，使光的强度减弱。若溶液的浓度不变，则在溶液中的光程越长，光线强度的减弱也越显著。设：入射光强度为 I0，透射光强度为 I，L 代表光在溶液中的光程。lg =K1LI0IK1是常数，受光线波长，溶液性质，溶液浓度影响。二 Beer 定律当一束光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若光程不变，则溶液的浓度越大，光吸收越强，透射光强度的减弱也越显著，光线减弱的比例与溶液浓度呈正比。lg =
2、K2CI0IK2为吸收系数，是常数。溶液对光吸收的强弱与溶液浓度 C 成正比。三 Lambert-Beer 定律将以上两个定律合并：lg =KCLIoI令 A=lg T= 则 A=KCL=-lgTIoI IIoT为透光度，A 为吸光度，K 为消光系数四 待测样品浓度的计算A 标 =KC 标 L A 样 =KC 样 L由于是同一物质及相同的光程，则：A 样 /A 标 =KC 样 L/KC 标 L=C 样 /C 标 即：C 样 =（A 样 /A 标 ）*C 样故已知标准溶液的浓度及吸光度，依据公式可计算出待测样品溶液的浓度。一 实验名称： BCA 法测定蛋白质含量二 实验原理：BCA 即二奎碄甲酸
3、。在碱性条件下，蛋白的肽键结构将二价铜离子还原为亚铜离子，亚铜离子与 BCA 试剂形成稳定的紫色络合物，并在 562nm 处有最大的光吸收值，该复合物颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，故可通过吸收值的大小对蛋白质进行定量。三 实验步骤：A 标准品的稀释：将 9 支干燥的 1.5ml 离心管编号，按表加入下列试剂：BCA法标准曲线和样品测定1.2ml离心管ddH2O（L）2mg/mLBSA（L）蛋白质终浓度（g/mL)A 0 50L 标准品 2000B 125 375L 标准品 1500C 325 325L 标准品 1000D 175 175LB 管混合液 750E 325 325LC 管混合液 5
4、00F 325 325LE 管混合液 250G 325 325LF 管混合液 125H 400 100LG 管混合液 25I 400 0 0=BlankB 配置 BCA 工作液：依据样品数量，将试剂 A 和试剂 B 按体积比 50:1 配制适量 BCA 工作液，并充分混匀。C 标准品及样品的测定：1）分别取 25L 上表中新鲜配制的 BSA 标准液和待测样品，加入到微孔板中；2）每孔中加入 200LBCA 工作液，并充分混匀；3）加盖，37孵育 30min 后冷却至室温或室温放置 2h；4）以 I 号管调零点，于 562nm 处测定各管吸光度5）以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲
5、线。计算样品的蛋白浓度。四 实验结果：实验数据如下：（加粗数据是样品吸光度） A STANDARD C1.831 1.951 20001.337 1.457 15001.031 1.251 10007500.611 0.755 5000.329 0.449 2500.162 0.282 1250.049 0.169 250 0.12 00.603 0.723 y = 0.0009x + 0.0688R2 = 0.991200.511.520 500 1000 1500 2000 2500系 列 1线 性 (系 列1)将样品数据代入方程：得出：x=726.89g/mL，即样品中的蛋白质浓度为 7
6、26.89g/mL五 讨论：1 从标准曲线中可以看出，溶液的蛋白质含量和吸光度成正相关，蛋白质含量越高，吸光度就越高。2 配制溶液时一定要细心，不要配错，正确使用移液枪，及时换枪头，避免污染；3 当离心管中已经注入溶液，小心不要因为过失而导致其漏液，造成损失；4 测定吸光度时注意调整波长；5 该方法快速，灵敏度高，试剂稳定性好，对不同种类蛋白质的检测的变异系数小，而且BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中化学物质的影响，低浓度的去垢剂不影响检验结果，在微孔板中进行测定，可以大大节约样品和试剂用量。6 此种方法的测定范围是 202000g/mL一 实验名称：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量：二 实验
7、原理：考马斯亮蓝在酸性条件下和蛋白质结合，使染料最大吸收值从 465nm 变为 595nm，在一定的线性范围内，反应液 595nm 处吸光度的变化量与反应蛋白成正比，测定 595nm 处吸光度的增加即可进行蛋白定量。测定范围为 50g-1000 g/ml三 实验步骤：A 考马斯亮蓝染液在使用前应平衡温度至室温并温和的颠倒混匀；B 标准品的稀释：将 7 支干燥试管编号，按表加入下列试剂：考马斯亮蓝法标准曲线和样品测定试剂 0 1 2 3 4 5 6BSA液（l）2mg/ml 0 5 10 20 30 60 0PBS(l) 150 145 140 130 120 90 150蛋白质终含量（mg/m
8、L) 0 0.067 0.13 0.27 0.4 0.8 0C 标准品及样品的测定1）将 5L 体积的样品加入到试管中，并用 PBS 补足到 150L；2）向各个试管中加入 2.85mL 考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置 5-10min；3）以 0 号管调零点，于 595nm 处测定各管吸光度；4）以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。计算样品的蛋白浓度。四 实验结果：标准曲线：y = 1.0698x + 0.1321R2 = 0.980300.20.40.60.811.20 0.5 1系 列 1线 性 (系 列 1)样品对应的吸光度为 1.148将样品数据代入方程：得出：x=94
9、9.6g/mL，即样品中的蛋白质浓度为 0.9496mg/mL五 讨论1 考马斯亮蓝可以和石英比色皿产生强烈的结合，建议使用玻璃或塑料比色皿；2 不同的蛋白可以和 CBBG的结合程度不同，因此使用被测蛋白作标准曲线，可以得到更准确的结果；3 应按蛋白浓度从低到高的顺序进行测定，测定过程请连续进行，不要清洗比色皿，因为水质会影响测定结果；4测定吸光度时注意调整波长；5 从标准曲线中可以看出，溶液的蛋白质含量和吸光度成正相关，蛋白质含量越高，吸光度就越高；6 此种方法的测定范围是 501000g/mL；7使用分光光度计时，每一次打开盖子后，都需要再次矫正，不然会产生误差；8在使用可见光分光光度计时，注意往装液体时不可过多，以防洒出损伤仪器。也不能过少，可能导致无法测量液体的分光度；9 由考马斯亮蓝法测得的蛋白质浓度和用 BCA法测得的蛋白质浓度有很大差距，原因我们分析有以下几点：1）我们可能在操作的过程中没有注意细节，比如试管中残留的蒸馏水没有完全除去，或者比色皿中的残留液体没有完全擦干，或者试液加入的量错误等等，这些错误是由我们实验者自身造成的，所以说这次试验并不是很成功，我们实验者要有一部分责任；2）仪器本身的误差也是客观存在的，比如移液枪的个体差异，有一些会因为枪或者枪头的原因使液体量多或者量少；分光仪器本身的误差等等。
