1、1曲霉脂肪酶编码基因的克隆与表达分析接入载体为 pET-28a，外源基因为 AFL-1，PCR 产物直接酶切（NdeI/BamHI）后纯化连接 pET28a外源基因信息：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=3504452 AFL1-1（Gene ID=3504452）序列信息统计如下：1 atggcttctc caattctgcg atcaccgatt acttcggacc tcgccaacgt aacacccgat61 ttggtggatg ttagcactcc cgaaaaattg aaatcctacc gcgaatcact tgaaccaatc12
2、1 ttcactttgg agaatatcat ccgagggaaa gagaacatca tctcctacga ggaactggac181 atcccaggcc ccgcaggacc gatgcgggcc accatcttcc gccccaagca ccaaacccac241 cctatcgatg aaatccctgg tatcctacac atccacggcg ggggcctcgc cacgggaaac301 cgcttcctgg gcttcaccat gctcgactgg gtcgagtccc tcggtgccgt ctgcctgacg361 gccgagtacc gtctcgcccc
3、ggaacatcac cagcccgccc agctggaaga cagctacgcc421 gcgctgcagt ggatgagcga ccacgccgcc gagctgggct tcaacccgcg caagctggtt481 gtctgcggta gctcggcggg gggcaatctc acggcggggg tcaccttact cgcgcgggac541 cgctcgggcc cgcaaatccg cggccaggtg ttgatctatc cgtgggttga cgatggcatg601 gactacgtgt ccatgcggca gtatgcggat attgcgcctg tg
4、agggacgt ggacgccgcc661 gtgttggcta attatgcgtt tggcgagagg cgcgagcacg cggatatgta tactgtgccg721 atgcgcgcga cgaatttcgc gggcttgccc ccgacgttta tcgatgtggg tgaggcggat781 gtgtttcgtg atcaggatat cgcgtacgcg tcggctttgt ggaaggatgg tgtctcgact841 gagttgcatc tgtggccggg cagttggcat gggtttgatg tctttgttcc tgatgctccc901 a
5、ttagtcggc gggcgagggc tgctcggttg gaatggcttc ggaagttgtt aagtgtgcct外源基因 PCR 扩增引物序列：P1: 5GCGCGGCAGC CAT ATG GCT TCT CCA ATT CTG CGA 3P2: 5GCTCGAATTC GGA TCC AGG CAC ACT TAA CAA CTT CCG AAG 3N 端保留了标签，用于亲和层析2实验流程安排第一天 外源基因的制备涉及实验：PCR、酶切、电泳、回收掌握实验原理：PCR 及基本要素和注意点、酶切、电泳、回收实验顺序：PCR 扩增 电泳纯化 酶切电泳 割胶及回收载体接种进度限制
6、点：PCR 为统一开机，需要所有同学完成后进行 上交样品：外源基因回收样品，标记好组号外源基因的 PCR 制备体系1# 2#总体积 50l 50lddH2O 35l 34l10buffer 5l 5ldNTP（2.5mM） 4l 4lP1（5pmol/l） 2l 2lP2（5pmol/l） 2l 2l模板 DNA 1l 2lTaq 酶（5U/ l） 0.25l 0.5lPCR 反应条件：退火温度 61 度 30s，延伸时间 1min。预变性：95 度，5min，变性 95 度，30s，退火 61 度，30s，延伸 72 度，1min，30 循环。延伸 72 度，10min，4 度保存。或取出实
7、验，或取出后-20 度保存。PCR 回收样品的酶切体系总体积 ddH2O PCR 回收产物 Buffer NdeI/BamHI40l 15l 20l 4l 0.6+0.6l酶切反应条件：37 度水浴保温 30 min。PCR 产物纯化：产品说明书DNA 片段回收：胶回收试剂盒说明书思考问题：1. PCR 中的退火温度和延伸时间如何确定？产物浓度不高的原因？32. PCR 实验中如果出现无产物，该如何分析原因？3. PCR 扩增产物如果保证其准确性？如果出现扩增基因点突变时，有何解决方法？4. 电泳中针对 300 bp 和 5.6 kb 的片段，胶浓度如何选择？5. 胶回收过程中出现无产物带时，
8、如何选择原因？4第二天 载体质粒的制备涉及实验：质粒抽提、酶切、电泳、回收、连接掌握实验原理：质粒抽提、连接及体系确定实验顺序：抽提质粒电泳酶切电泳割胶回收电泳 连接感受态接种进度限制点：均为各组独立实验，无限制点 上交样品：载体质粒（P） 、载体酶切片段（F） 、连接样品（L） ，标记组号质粒提取：产品说明书载体质粒双酶切Total 40 lddH2O 34-X l10buffer 4 l质粒 DNA X l NdeI/BamHI 1+1 l酶切反应条件：37 度水浴保温 30 min。正常情况下，全做酶切。 （因回收后条带较淡）连接体系 10Buffer 载体片段 外源片段 T4 DNA
9、连接酶15 l 1.5 l X l Y l 0.5 l连接反应条件：4 度水浴保温过夜。思考问题：1. 质粒的拷贝数通常有哪些？对于低拷贝质粒的制备该如何进行？2. 未酶切的质粒正常带型是如何分布的？如出现异常现象该如何处理？3. 双酶切如发生酶切不完全时，产物带如何分析？在电泳中如果观察？ 4. 重组质粒构建中外源和载体的投入量如何确定？针对不同粘性末端的 DNA 片段连接该注意什么？5. 大体积酶切（如 1ml 体积，DNA 量为毫克级）该如何设计酶切体系和酶切时间？5第三天 转化与 RNA 抽提涉及实验：感受态细胞制备、转化、RNA 抽提掌握实验原理：细菌细胞感受状态、转化、细菌 RNA
10、 抽提实验顺序：翻瓶(7:30)感受态细胞制备RNA 抽提 转化RNA 样品电泳 涂板进度限制点：冷冻离心和操净台公用上交样品：涂布平板 2 块/组，统一放置 37 度培养箱大肠杆菌感受态细胞的制备1. 用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于 LB 固体培养基上，37下隔夜培养。2. 挑取单菌落接种于 30ml LB 液体培养基中，37下隔夜培养。3. 按 1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于 30ml LB 培养基中。4. 在 37的水浴摇床中培养 1.5 小时，OD 600 接近 0.5。 （ 以上步骤教师完成）5. 4，6 000 rpm 离心 10 分钟收获菌体。 1.0ml/管，4 管/
11、组6. 上述菌体沉淀用 100 l/管的 100 mmol/L CaCl2（冰冻）悬浮，并合并于一管，4 , 6 000 rpm 离心 10 分钟。7. 弃上清，将沉淀用 100 l 的 100 mmol/l CaCl2（冰冻）重新悬浮。8. 冰水浴中放置 3-5h 放可使用。RNA 抽提：产品说明书大肠杆菌的转化1. 取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。2. 在 90 l 感受态细胞悬浮液，加入 6 l DNA 连接溶液，轻轻混匀，在冰水浴中放置 30 分钟。3. 混匀，42水浴中脉冲 2 分钟，快速转移至冰水浴中，加入 900l LB 培养基，37摇床培养 11.5 小时。（4
12、2热脉冲前混匀菌体）4. 吸取适量已转化的感受态细胞涂布于 100g/ml 卡那霉素的 LB 平板上。（涂布量确定？本次实验离心后弃上清 850l，离心条件 4，6000rpm ，5min ）5. 37下倒置培养 1216 小时后计数。思考问题：1. 大肠杆菌转化除了感受态细胞转化方法外，还有哪些方法？2. 细菌 RNA 的半衰期特点？如何判断 RNA 的抽提质量？3. 抽提 RNA 过程中为何要带手套和口罩？常规 DNA 电泳可以分析 RNA 抽提质量否？4. 转化子筛选原理？一般筛选中还有哪些方法？5. 转化完成最后筛选平板上几乎没有转化子，转化失败可能的原因有哪些？6第四天 重组子鉴定与
13、转录水平的表达分析 涉及实验：转化计数、单菌落接种、菌落 PCR、RT-PCR掌握实验原理：转化子与重组子、RT-PCR实验顺序：菌落接种（Eppedorf）RT-PCR 电泳 菌落 PCR电泳接种进度限制点：PCR 为统一开机，需要所有同学完成后进行上交样品：接种重组子的试管 1 根/组，统一放置 37 度摇床培养逆转录体系（电子产品说明书 RR037A） 5Buffer (含 dNTP)Enzyme Mix Oligo dT Random 6mers RNA RNA Free dH2O10 l 2 l 0.5 l 0.5 l 0.5 l 1 l 5.5 l对照 5Buffer Enzyme
14、 Mix Oligo dT Random 6mers RNA RNA Free dH2O10 l 2 l 0 l 0.5 l 0.5 l 1 l 6 l逆转录反应条件：37 15min 85 5 sec PCR 体系：逆转录组 对照组总体积 20l 20lddH2O 7l 7l2MIX 10l 10lP1（5pmol/l） 1l 1lP2（5pmol/l） 1l 1l模板 DNA（逆转录溶液） 1l 1l菌落 PCR总体积 25lddH2O 10l2MIX 12.5lP1（5pmol/l） 1lP2（5pmol/l） 1l模板 DNA（菌液） 0.5l每组完成 4 个菌落的 PCR 鉴定，其中
15、 BL21（DE3）和 DH5a 各两个；PCR 反应条件：退火温度 61 度 30s，延伸时间 1min。7预变性：95 度，5min，变性 95 度，30s，退火 61 度，30s，延伸 72 度，1min，30 循环。延伸 72 度，10min，电泳鉴定。思考问题：1. 逆转录过程中需要注意 RNA 酶污染情况否？为什么？2. RT-PCR 是定性分析外源基因表达情况？如果要进行定量分析外源基因表达情况，如何设定内参？3. 菌落 PCR 的模板 DNA 来源何处？为何能直接以菌液模板进行 PCR？血液样品可否直接 PCR？4. PCR 预混液主要包括哪些组份？如进行批量转化子的菌落 PC
16、R 鉴定，如何实验可以大大节约时间？如果没有购买预混液，可否自行配制？如果进行？8第五天 重组菌的蛋白表达涉及实验：重组菌表达、SDS-PAGE 灌胶、蛋白电泳掌握实验原理：诱导、SDS-PAGE 电泳实验顺序：翻瓶制分离胶诱导制浓缩胶菌体样品处理点样电泳进度限制点：菌体培养摇床公用上交样品：无SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶配制组 分 分离胶（l ） 浓缩胶（l ）双蒸水 1650 270030丙烯酰胺 2000 670（甲叉双丙烯酰胺）分离胶缓冲液（PH8.8） 1250 浓缩胶缓冲液（PH6.8） 50010SDS 50 4010过硫酸铵 50 40TEMED 2.5 2.5总体积 50
17、00 4000菌体电泳样的制备将菌体均匀悬浮，测 OD600，若1，则稀释，离心，弃上清，按照 1OD/1ml 沉淀中加入 100l 1* loading buffer (50 水+50l 2*loading buffer)，悬浮，沸水浴 5min，离心后，3l 上样。例如：若 OD600nm 为 0.6，体积为 0.5，则所得沉淀中相应加入0.6*0.5=30l 1*loading buffer （15l 水+15l 2*loading buffer）9资料复印：上述 6 页、PCR 产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒和 RNA 抽提试剂盒的说明书讲解内容：周一（准备）：移液器使用
18、、实验总体克隆方案、整个实验周期内需要注意的问题（实验的连续性及空余时间的利用、实验的安全、实验报告-总结报告）周二（Day1）：PCR 基本原理、基因克隆中 PCR 的常规难点（模板-DNA、cDNA）、利用基因同源序列进行全长克隆的方法、模板和酶的优化等问题周三（Day2）：质粒抽提的基本原理（碱裂解法、低拷贝大质粒的抽提方法、特殊受体来源的抽提方法）、限制性内切酶的定义、酶切体系的设计、多样品同种酶切的实验快速方法、大量 DNA 酶切的方法、联合酶切、不同公司来源的酶混合联用等，快切酶技术等。周四（Day3）：感受态细胞类型（克隆受体、表达受体）、 DNA 连接效率的决定因素、转化效率的限制因素、转化实验的对照设置及转化效率低的原因分析、RNA 抽提原理等周五（Day4）：重组鉴定的方法（标记基因、PCR 鉴定、酶切鉴定、测序验证）、PCR 模板（菌液、血液。）、RT-PCR 的定性和定量分析与内参选择周六（Day5）：表达系统（大肠杆菌、链霉菌、酵母、动物细胞。）
