实验5叶绿体的分离与观察

1、在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后3000r/min离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
在室温下进行分离要迅速。
,三、实验用品： 1、试剂: 0.35mol/L 氯化钠溶液 0.01%吖啶橙荧光染料。
2、材料: 新鲜菠菜 3、器材：150ml烧杯, 50ml 量筒 , 滴管 , 10ml 刻度离心管, 纱布若干，载片和盖玻 片。
4、设备：离心机、研钵、天平、普通光学显微镜、荧光显微镜。
,1.叶绿体的分离 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除粗梗及叶脉，称取10g叶片于研钵中，先加5ml 0.35mol/L NaCl 溶液充分研磨，加至50ml，继续研磨。
将匀浆用 4层纱布过滤于150ml 烧杯中。
取滤液 8ml 在 1000r/min 下离心 2min，弃去沉淀。
将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
,四、实验方法与步骤：,2.叶绿体的观察 将沉淀用 0.35mol/LNaCl 溶液悬浮。
取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。
取叶绿体悬液一。

2、荧光）,常用的细胞破碎方法,离心分离技术,离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。
分离各种细胞组分的方法主要有： 差速离心 密度梯度离心 速率-区带梯度离心 等密度离心,差速离心,主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取,密度梯度离心,用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。
这类分离又可分为速率-区带梯度离心和等密度梯度离心两种。
优点是一次离心可分离提纯样品中几种组份，用于较精细的分离。
,速率-区带梯度离心和等密度梯度离心,原理：根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，通过。

3、实验二叶绿体的分离与荧光观察 一 实验目的 1 了解叶绿体等细胞器分离的一般原理和方法2 熟悉荧光显微镜的使用方法 观察叶绿体的自发荧光和间接荧光 二 原理 差速离心是分离细胞器的一般方法 通过离心力和时间的增加 可将不同的组分分批次沉降 从而分离出各种亚细胞组分 叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器 能发生特有的能量转换 利用低速离心机可以分离叶绿体 其分离在等渗溶液 0 35mol L氯化钠或0。

4、心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
,Low speed,High speed,Differential centrifugation,试剂与器械1. 器材 : 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，载片和盖片各4片。
2. 试剂: 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。
,三.实验步骤 （一）叶绿体的分离与观察 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。
3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。
5. 将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去。

5、大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
,实验原理,叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。
然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。
分离过程最好在05的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
,实验步骤,一、叶绿体的提取 新鲜的嫩菠菜叶洗净擦干去除叶梗脉，取20克放入放入匀浆器中，加入100mL0.35mol/L氯化钠溶液，快速研磨成匀浆。
将匀浆液用6层纱布过滤于50mL小烧杯中。
1、取1ml 虑液1000r/min离心2min（去除组织残渣和未被破碎的细胞），弃去沉淀，2、取上清液在 3000r/min离心5min，保留沉淀（即混有部分细胞核的叶绿体） 3、将沉淀用大约0.2-0.3 mL氯化钠溶液悬浮， 4、取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，盖上盖波片，光学显微镜下观察 。
可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部。