1、实验三 叶绿体的分离与荧光观察,生命科学学院,细胞生物学实验,一、实验目的： 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。,二、实验原理：叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心可以将叶绿体分离，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。 将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后3000r/min离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温下进行分离要迅速。,三、实验用品： 1、试剂: 0.35mol/L 氯化
2、钠溶液 0.01%吖啶橙荧光染料。 2、材料: 新鲜菠菜 3、器材：150ml烧杯, 50ml 量筒 , 滴管 , 10ml 刻度离心管, 纱布若干，载片和盖玻 片。 4、设备：离心机、研钵、天平、普通光学显微镜、荧光显微镜。,1.叶绿体的分离 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除粗梗及叶脉，称取10g叶片于研钵中，先加5ml 0.35mol/L NaCl 溶液充分研磨，加至50ml，继续研磨。 将匀浆用 4层纱布过滤于150ml 烧杯中。 取滤液 8ml 在 1000r/min 下离心 2min，弃去沉淀。 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核
3、）。,四、实验方法与步骤：,2.叶绿体的观察 将沉淀用 0.35mol/LNaCl 溶液悬浮。 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 取叶绿体悬液一滴滴载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染液染色 1min，在荧光显微镜下观察，可见叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则发出绿色荧光，气孔仍为绿色。,3.菠菜叶徒手切片观察 用单面刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载玻片上，滴加12滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后轻压，置于普通光镜和荧光显微镜下观察。 用同样的方法制片，滴加12滴0.01%吖啶橙染液染色1min，洗去余液，加盖片后在荧光显微镜下观察。,注意事项 ： 1、叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 2、分离过程最好在04下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 3、离心时，离心管要平衡。 4、凡是荧光染料都有一定毒性，请注意保护！ 5、汞灯开启后15min内不要关灯，关闭后15min内不要开启。,五、实验结果与分析：,1. 简述叶绿体分离的实验原理和方法。 2. 在分离叶绿体时应注意哪些问题？ 3. 绘出菠菜叶肉细胞的形态，显示叶绿体。,
