1、实验六 叶绿体的分离与观察,叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。,实 验 目 的 1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并了解荧光显微镜的使用方法。,实验原理组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。 一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各
2、种亚细胞组分。,Low speed,High speed,Differential centrifugation,试剂与器械1. 器材 : 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，载片和盖片各4片。 2. 试剂: 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。,三.实验步骤 （一）叶绿体的分离与观察 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。2. 利用组织捣碎机低速(5000r/m
3、in)匀桨3-5min。3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体 (混有部分细胞核)。6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。,（二）菠菜叶手切片观察 新鲜菠菜叶 刀片切出一斜面置于载玻片上 滴加12d氯化钠溶液 盖上盖片显微镜下观察,实 验 结 果 （一）叶绿体的分离和观察 1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
4、 2. 以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。 3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。,（二）菠菜叶手切片观察 1. 在普通光镜下可以看到三种细胞 (1)表皮细胞: 为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细胞: 为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞: 为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。,2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱, 气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红
5、色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。 3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍为绿色。,3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍为绿色。,作 业 1. 根据荧光观察结果，绘制菠菜叶气孔的结构模式图。 思考题： 1. 叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意些什么问题？,五. 实验结果 1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 2. 用目微尺和台微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测量5-10个叶绿体，求其平均值。 六. 思考题 分别计算不同物镜放大倍数下测微尺的单位。 2. 鸭红细胞直径为多少微米.,
