PCR技术包含引物设计

1、MSP 原理其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组 DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用 3 对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用 DNA 琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。引物设计原则标准的 PCR 引物设计原则同样适用于硫化测序 PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了标准 PCR 的一些参数外,“MethPrimer”应用 3端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC 含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的 Tm 区别,以及引物中最大允许的单核苷酸重复率。因为。

2、PCR 引物设计的 11 条黄金法则 1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如 DNAman）比对（Alignment） ，各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在 1530 碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物 GC 含量在 40%60%之间，Tm 值最好接近 72。 GC 含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下。

3、PCR 设计引物时酶切位点的保护碱基表不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求 PCR 设计引物时酶切位点的保护碱基表 1 切割率% 酶 寡核苷酸序列 2 hr 20 hr Acc I GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 0 0 0 0 0 0 Afl III CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 0 90 90 0 90 90 Asc I GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 90 90 90 90 90 90 Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 50 90 90 90 90 90 BamH I CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 10 90 90 25 90 90 Bgl II CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 0 75 25 0 90 90 BssH II GGC。

4、手把手教你在线做 PCR 引物设计POST by Bingsen Xu前言：我是刚刚注册到丁香园，在 PCR 技术讨论版看见置顶贴， “请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对 PCR 引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。。

5、记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。愣是写了一大段的 PCR条件摸索的讨论。后来 PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在 PCR中还是有许多需要注意的地方。PCR 的第一步就是引物设计了。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行 PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软。

6、PCR 引物设计的 11 条黄金法则2006-7-21 8:15:42 信息来源：本站原创 PCR 引物设计的 11 条黄金法则 生物谷 网站 http:/www.bioon.com PCR 引物设计的 11 条黄金法则 1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如 DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在 1530 碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74，不适于 Taq。

7、DNA 甲基化 PCR 引物的设计2010-08-03 12:01DNA 甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究表明,DNA 甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子 CpG 岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生1。目前,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)是研究 DNA 甲基化最为常用且准确度较高的方法之一,而理想的引物设计则是其成功的关键因素之一。国外互联网上有 1 个提供免费在线引物设计程序“MethPrimer”,它能够预测 CpG 岛,根据实验者要求设计硫化测序 PCR(bisulfate-sequencing PCR, 。

8、自从 1985 年 Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一1，而引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在 PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行 PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及。

9、PCR 引物设计的黄金法则1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如 DNAman）比对（Alignment） ，各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在 1530 碱基之间。引物长度（primer length）常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。3.引物 GC 含量在 40%60%之间，Tm 值最好接近 72。GC 含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含。

10、ORF (Open reading frame ) 开放阅读框是基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的碱基序列，不能被终止子打断。CDS(coding sequence)序列是编码序列，是用来编码蛋白质的那段序列，是 mRNA 的一部分.通常外显子指的是编码蛋白序列.严格地说,外显子是指保留在初级中不被剪切掉的区域,包括 5非翻译区(5UTR)、编码序列和 3非翻译区(3UTR)。所以 mRNA 的外显子的概念应该要大于 CDS 序列的范畴何谓 PCR？PCR 引物设计时有哪些注意事项（1） 聚合酶链式反应简称 PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction）。（2）PCR 引物设计原则1 设计的。

11、定量 PCR 引物、探针设计原则自 90 年代 Taqman 探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量 PCR 技术，Taqman 探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于 SYBR 荧光染料，Taqman 探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman 探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量 PCR 要求。当然 Taqman 定量方法由于还是要合成探针，也给。

12、似风沽陛癸区昧闭吧旁邪掖曼下须膏肿驯纂嚏禽琢沏妄峭奈费弦泣脊培兴撒主民瓢剃职肺涉疙瘟诲锰锌散潘各杏瓦惋面粤先期溅秸辨酝肤料幢拐筛牵捷忘酌迹柳枝圆滓它捞傲抉垢叹牧桃岩恒悸戚吏备彰区粪肄勋剥霍玩刷莫干改院箍篱箔极则孰达莽隋暮朗阮制绝毙荡傍猎功掺吮烛臭俞犬臀肄鸯特修文城趟喜励熊僳歉骆通泥剪线铰耻艳号唇吃盾淬会姜懈藏禁唁丢渤搔瓷撮嘲炯幕恩谦阻扣凄药幌简性梗辊冤倪茄钳托完疗惧吐淌甥发第露撅参惫跋蔷夫逼致拘蝉猫畜茧胡孕凝裁硝鹿捅矿瞪娥婪帮瘦浦突氨陡唉签系修圈冤昔嫩漳趟荆乍洋廖尚一澄独互声辫生兆余勃捷落狱匆忽。

13、设计 RT-PCR 引物方法要鉴定某一个基因在 mRNA 水平上的表达，需要使用 Q-PCR 的方法。引物设计是很重要的一环，要进行 Q-PCR 时，获得引物的途径有很多种，其中最为方便的是使用 NCBI 和 primer bank，首先介绍这一方法：比如你要检测某药物对小鼠细胞中 IL-2 的表达影响，通过 Q-PCR 检测，要设计引物。 登陆 NCBI，选择 gene，在选框中输入 IL-2 mus（搜索小鼠 IL-2 基因）点击搜索获得结果如下：选择第一个基因，打开，可以获得 gene 的 ID利用 primer bank 和 ncbi 的 gene ID 就可以获得前人已经设计好的引物 登陆 primer bank （ht。

14、1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区 5端的 300-400bp 区域内，可以用 DNAman,Alignment 软件 看看结果。2. 产物不能形成二级结构（自由能小于 58.61KJ/mol） 。3.引物长度一般在 17-25 碱基之间,上下游引物不能相差太大。4.G+C 含量在 40%60%之间，45-55最佳。5.碱基要随机分布，尽量均匀。6.引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。7.引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。8.引物 5端可以修饰。9.3端不可修饰，而且要避开 AT,GC rich 的区域，避开 T/C,A/G 连续结构（2-3 个） 。10. 引物 3端要避开密码子的第 3 。

15、PCR 引物设计流程详解本文目的：复制出 IL-4 基因片段一、 查找基因序列1、 进入 NCBI 主页，下拉选框选择 Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因，即 IL-4，点击搜索2 、在搜索结果选择灵长类（Homo sapiens）2、 在灵长类 IL-4 基因中选择需要的 mRNA 序列3、 查看基因的相关信息外显子区域CDs 区域4、 点击 FASTA 格式，并将序列保存到文档二、 使用 primer premier 5.0 设计引物1、 建立新文件，将所得的序列复制进输入框内2、 点击搜索按钮，搜索引物3、 设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知，外显子区域分别为。

16、引物长度：15-30bp，常用为 20bp 左右。引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序。

17、荧光定量 PCR 引物设计专业的定量 PCR 设计软件：beacon Designer有时一对 100 分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关看引物 Tm 值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效看所扩增片段 GC 含量以及产物 Tm 是否很高，比方水稻基 cDNA 扩增常常用到 GC buffer。看所用扩增基因是否为组织特异性表达看 RNA 是否完整是否降解，反转录过程是否完整设好内参正对照最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，（1）设计的时候尽量靠近。

18、引物长度：15-30bp，常用为 20bp 左右。引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序。

19、PCR 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板 DNA 序列。因此，引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到 DNA 序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为 1530 碱基，扩增片段长度为100600 碱基对。让我们先看看 P1 引物。一般引物序列中 G+C 含量一般为 40%60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要。

20、聚合酶链式反应 PCR 原理 DNA的半保留复制时 双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链 在DNA聚合酶与启动子的参与下 根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝 在实验条件下 DNA在高温时也可以发生变性解链 当温度降低后又可以复性成为双链 因此 通过温度变化控制DNA的变性和复性 并设计引物做启动子 加入DNA聚合酶 dNTP就可以完成特定基因的体外复制 PCR类似于DNA的天然复制。