荧光定量PCR引物设计.doc

1、荧光定量 PCR 引物设计专业的定量 PCR 设计软件：beacon Designer有时一对 100 分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关看引物 Tm 值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效看所扩增片段 GC 含量以及产物 Tm 是否很高，比方水稻基 cDNA 扩增常常用到 GC buffer。看所用扩增基因是否为组织特异性表达看 RNA 是否完整是否降解，反转录过程是否完整设好内参正对照最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，（1）设计的时候尽量靠近基因的 3端，这样能最大限度地保证扩

2、增效率（2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染（3）两条引物的 Tm 值不要相差太大（4）产物长度保证在 80200bp 之间，最长 300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的 Tm 值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物 Tm80 以上（一般 Tm=80 以下的峰都是引物二聚体） ，对于水稻等 GC 含量比较高的基因组，产物 Tm 不要高于 94(个人观点)。如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的 Tm 值与内参产物的 Tm 相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。（3）相对错配来说，我认为 dimer 和 ha

3、rpin 对 realtime PCR 的影响更大（当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了） ，引物的 3端不要有错配。（5）一般我们用 Primer Premier 设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是 100 的，再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的引物，一般 5 分钟之内可以搞定一个基因。实时定量 PCR 引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区 5端的 300-400bp 区域内，可以用 DNAMAN，Alignment 软件看看结果。2、不能形成

4、2 级结构。3、引物长度一般在 17-25bp 之间，上下游引物不能相差太大。4、G+C 含量在 40-60%之间，45-55%最佳。5、碱基要随机分布，尽量均匀。6、引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。7、引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。8、引物 5端可以修饰。9、3端不可修饰，而且要避开 AT，GC rich 的区域，避开 T/C, A/G 连续结构（2-3 个）。10、引物 3端要避开密码子的第三位。11、引物整体设计自由能分布 5端大于 3端。12、定量产物长度 80-150bp 最好，最长是 300bp。实时定量 PCR 完全手册方法简介所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过

5、对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。广 义 概 念 下 的 定 量 PCR 技 术 可 以 分 为 五 种 类 型 ： （ 1） 外 参 法 +终 产 物 分 析 。 所 谓 “外 参 法 ”是 指 样 本 与 阳 性 参 照 在 两 个反 应 容 器 内 反 应 。 这 种 类 型 没 有 对 样

6、 本 进 行 质 控 监 测 ， 易 出 现 假 阴 假 阳 结 果 ，没 有 监 测 扩 增 效 率 ， 定 量 不 准 。 （ 2） 内 参 法 +终 产 物 分 析 。 所 谓 “内 参 法 ”是 指 样 本 与 阳 性 参 照 在 一 个反 应 容 器 内 反 应 。 这 种 类 型 对 样 本 进 行 质 控 监 测 ， 排 除 假 阴 结 果 ， 但 是 定 量不 准 。 （ 3） 外 标 法 +过 程 监 测 。 这 种 类 型 监 测 扩 增 效 率 ， 阳 性 样 本 定 量 准 ， 但是 无 法 排 除 假 阴 结 果 。 （ 4） 内 参 法 +过 程 监 测 。 由 于

7、 样 本 与 阳 性 参 照 在 一 个 容 器 内 反 应 ， 用 同样 的 Taq 酶 和 反 应 参 与 物 ， 存 在 竞 争 性 抑 制 ， 起 始 模 板 量 浓 度 高 的 反 应 会 抑制 起 始 模 板 量 浓 度 低 的 反 应 ， 所 以 定 量 不 准 。 （ 5） 外 标 法 +过 程 监 测 +内 对 照 。 这 种 类 型 监 测 扩 增 效 率 ， 阳 性 样 本 定量 准 ， 同 时 排 除 假 阴 结 果 。 这 种 类 型 是 应 该 提 倡 的 。 在 国 家 没 有 出 台 阴 阳 判 定 标 准 时 ， 所 用 PCR 系 统 灵 敏 度 最 好 达

8、 到 一 个拷 贝 （ 一 个 病 毒 ） 。 从 理 论 上 说 ， 只 要 有 一 个 拷 贝 数 ， 样 本 就 算 阳 性 ； 一 个拷 贝 数 都 没 有 才 算 阴 性 。 所 谓 的 实 时 荧 光 定 量 PCR 就 是 通 过 对 PCR 扩 增 反 应 中 每 一 个 循 环产 物 荧 光 信 号 的 实 时 检 测 从 而 实 现 对 起 始 模 板 定 量 及 定 性 的 分 析 。 在 实 时 荧光 定 量 PCR 反 应 中 ， 引 入 了 一 种 荧 光 化 学 物 质 ， 随 着 PCR 反 应 的 进 行 ，PCR 反 应 产 物 不 断 累 计 ， 荧 光

9、信 号 强 度 也 等 比 例 增 加 。 每 经 过 一 个 循 环 ， 收集 一 个 荧 光 强 度 信 号 ， 这 样 我 们 就 可 以 通 过 荧 光 强 度 变 化 监 测 产 物 量 的 变 化 ，从 而 得 到 一 条 荧 光 扩 增 曲 线 。 PCR 过 程 的 监 测 有 多 种 检 测 模 式 。 最 常 用 的 有 三 种 检 测 模 式 ： （ 1） R Green I 检 测 模 式 。 温 度 循 环 为 945572C 三 步 法 ， 只 有 引物 ， 无 探 针 ， 荧 光 染 料 镶 嵌 在 双 股 螺 旋 链 中 间 。 通 过 对 特 定 方 向 的

10、强 荧 光 检测 获 得 信 号 ， 这 种 试 剂 检 测 模 式 易 产 生 非 特 异 信 号 ， 且 本 底 光 较 大 。 （ 2） 解 探 针 模 式 （ Taqman） Hydrolysis Probe 。 温 度 循 环 为 9460C 二 步 法 ， 不 仅 有 引 物 ， 还 有 另 外 一 个 特 异 针 对 扩 增 模 板 的 探 针 在 引 物 对 之间 。 在 探 针 相 邻 两 个 碱 基 上 分 别 结 合 两 个 荧 光 染 料 ， 一 个 染 料 接 受 激 发 光 得到 的 能 量 传 给 了 第 二 个 染 料 ， 接 受 能 量 的 第 二 个 染 料

11、 通 过 发 射 特 征 光 子 回 到稳 定 态 。 当 Taq 酶 在 60C 延 伸 扩 增 链 时 ， 遇 到 探 针 ， 利 用 Taq 酶 53外 切 酶 活 性 将 探 针 水 解 成 单 个 碱 基 ， 单 个 碱 基 之 间 距 离 较 远 ， 第 一 个 染 料 的能 量 无 法 传 给 第 二 个 染 料 ， 只 好 通 过 发 射 特 征 光 子 回 到 稳 定 态 ， 通 过 对 溶 液中 第 一 个 染 料 的 荧 光 检 测 获 得 信 号 。 这 种 试 剂 检 测 模 式 增 加 了 检 测 信 号 的 特异 性 ， 但 是 由 于 利 用 了 Taq 酶 5

12、3外 切 酶 活 性 ， 一 般 试 剂 厂 家 只 给 Taq酶 的 聚 合 酶 活 性 定 标 ， 没 有 同 时 给 Taq 酶 53外 切 酶 活 性 定 标 ， 不 同 批号 试 剂 之 间 会 给 定 量 带 来 差 异 。 另 外 对 探 针 的 熔 点 温 度 （ Tm） 仅 要 求 其 高于 60C， 这 就 使 不 同 试 剂 盒 之 间 的 特 异 性 参 差 不 齐 ， 而 且 无 法 做 质 控 检 测 。 （ 3） 杂 交 探 针 （ Hybridization Probes） 模 式 。 温 度 循 环 为 945572C 三 步 法 ， 有 引 物 ， 二 个

13、特 异 针 对 扩 增 模 板 相 邻 的 探 针 在 引 物 对 之 间 ， 在一 个 探 针 3碱 基 上 结 合 一 个 荧 光 染 料 ， 在 另 一 个 探 针 5碱 基 上 结 合 第 二 个荧 光 染 料 。 在 55C 时 ， 两 个 探 针 都 刚 好 接 合 在 模 板 上 ， 第 一 个 染 料 接 受 激发 光 得 到 的 能 量 传 给 了 第 二 个 染 料 ， 接 受 能 量 的 第 二 个 染 料 通 过 发 射 特 征 光子 回 到 稳 定 态 ， 通 过 对 结 合 在 扩 增 模 板 上 双 探 针 中 第 二 个 染 料 的 荧 光 检 测 获得 信 号

14、 。 这 种 试 剂 检 测 模 式 中 荧 光 信 号 与 特 定 杂 交 温 度 相 关 ， 探 针 的 浓 度 始终 保 持 不 变 ， 因 此 可 以 在 扩 增 后 检 测 熔 解 曲 线 作 为 信 号 的 特 异 性 质 控 。 另 外这 种 试 剂 检 测 模 式 可 以 用 于 点 突 变 检 测 。RT-qPCR 是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反转录酶将 RNA 反转录成 cDNDA;2.扩增:用 PCR 的方法扩增 cDNA;3.检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR 影响分析可靠性关键点(Key porint):1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检

15、测方法设计2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对 RT-qPCR 的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总 RNA 或者 mRNA4.RNA 反转录成 cDNA 的不同的引发策略5.不同的酶以及酶的不同组合

16、6.变异系数、灵敏度7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响 RT-qPCR 的可信度，重复性。RNA 质量评价现在 RNA 定量的程序很多。最近 EMBO qPCR course (http:/www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28) 比较了用 Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。

17、结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有 RNA 样品的评价。RNA 质量RNA 质量主要包括 RNA 的纯度（没有蛋白质和 DNA 的污染）以及完整性。传统的 RNA 质量的评价通过分析 A260/A280 的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA 的条带的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent 的 2100 也是一种十分好的分析 RNA 质量的方法，它通过分析 18S 以及 28S rRNA 的分析图谱，通过图谱来反应

18、RNA 的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的 RINs 在 10-4 之间。10 代表完整的 RNA，4 代表没有完整的 rRNA 带。由于以上的方法并非 100准确定反应 mRNA 的完整性，因为他们只是反应rRNA 的量来间接测定 mRNA 的完整性。这里推荐一种方法：采用 GAPDH 的3：5分析法。我们使用 oligo dT 进行逆转录，然后对逆转录的 cDNA 用 multiplex 荧光定量评价。设计三个 taqman 探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于 3;5以及中部。扩增产物的之间的比值反应 RNA 的完整性。如果 3;5的比值在

19、1,反应较高度完整性，如果高于 5 说明降解。QRT-PCR 抑制物的组成QRT-PCR 抑制物严重减少了 PCR 的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin 以及 IgG.是否有抑制物的评价体系：1.通过对目的样品进行梯度稀释进行 PCR 扩增效率的检测2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况3.用细菌检测临床样品的抑制4.通过标准人工合成的扩增进行 RT-PCR 来反应目标检测物的抑制情况反转录反应系统1.RT 和 PCR 单一酶系统2.RT 和 PCR 分离的酶系统3.RNA

20、 逆转录引物的选择引物主要有三种：1.随机引物：随机引物，特别是 6nt 引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用 15nt 的随机引物.2.oligo-dT：只能用于 mRNA 完整的样品，特别有 polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的 3UTR 的区域比较困难3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别 RNA 量足够情况下建议使用此法。PCR 优化PCR 优化主要有：1.引物的浓度2.建议使用 SYBR Green I 和 EvaGreen 进行扩增和溶解曲线的测试笔者建议的操作流程:一靶的选择和试验设计1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已

21、经证实的 QRT-PCR 的扩增引物,探针以及反应条件.RTPrimerDB (http:/medgen.ugent.be/rtprimerdb), 相对物种较多PrimerBank (http:/pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html) 人，鼠Real Time PCR Primer Sets (http:/www.realtimeprimers.org) 人，mouse ，rat如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:A.最广泛使用的商业化的软件 Beacon Designer(http:/)B.DIY 的软件 Prim

22、er ExpressC.如果 Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择 Sigma-Genosys http:/)的服务方案,详细周到D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序 : http:/ 4-6 对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与 NCBI 的网站进行比对,并且用 NCBI 的 ePCR 进行虚拟的电子 PCR引物设计简介DNA 引物长度:15-25 个碱基 GC 含量:50%左右如果引物的与 AT 区域富集结合,可以考虑用 LNA 替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和 3端

23、二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率降低,因此我们选择引物二聚体的G 为负值,即:10 kcal/mol.没有连续的 G/C.二、引物探针的保存一般遵循以下原则:1.正向和反向引物保存在-20 度, 浓度为 10mM 或者 10工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70 度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。2.输入靶序列，用 BLASTN 在 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast 进行比对3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计4.靶序列中

24、避免直接重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低 DNA 的扩增效率以及减少分析的灵敏度。5.考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过分析内含子以及外显子的边界，主要通过 cDNA 和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组 DNA 的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用 DNA 做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用 DnaseI 处理样品，除去 gD

25、NA 的污染。6.在 RT 步骤时，用(http:/www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi)工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低7.尽可能用 60-150bp 的扩增产物，GC 含量在 60或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。GC 含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是的扩增时间缩短 gDNA 污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用 oligodT 进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的 3区域.实时定量 PCR 体系的优化1.基

26、本参数的优化：1)MgCl2 的浓度：在 PCR 反应中，MgCl2 的浓度对酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的 MgCl2 的浓度还能在反应中得到较低的 Cp(crossingpoint)值(指 PCR 达到指数扩增期时，产生一定的荧光高于背景并为仪器所识别时的循环数)，较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以对其的浓度选择应慎重。一般来说，对以 DNA 或 cDNA 为模板的 PCR 反应，应选择 2-5mM 浓度的MgCl2，对以 mRNA 为模板的 RT-PCR 而言，则应选择的浓度为 4-8mM。2)模板的浓度：如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验

27、，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度(高和中、低浓度)来进行实验。一般而言，使 Cp 位于 15-30 个循环比较合适，若大于 30 则应使用较高的模板浓度，如果 Cp 小于 15 则应选择较低的模板深度。对于 Cp 值的确定，经验上是 SYBRGreenI 探针的荧光信号比本底高 2 倍，杂交探针的荧光强度比本底高 0.3 倍。2.使用 SYBRGreenI 测定 DNA 时的条件优化：1)MgCl2 的浓度：大多数引物 -模板对其的要求是 2-4mM。2)模板的浓度：初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个稀释的度的测定。DNA 在 50ng-

28、5pg 之间选择，质粒 DNA 在 106 拷贝数左右。3)引物的浓度：引物的浓度是一个影响 PCR 反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数 PCR 反应，0.3uM 是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在 0.1-1.0uM 之间进行选择，直至达到满意的结果。4)退火温度：首次实验设置的退火温度应比计算得出的 Tm 值小 5，然后在1-2内进行选择。一般的，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的 Tm 值有一定的差距。3.用 SYBRGreenI 进行一步法 RT-PCR 的条件优化：1)

29、MgCl2 的浓度：不同的靶分子选用不同的浓度，通常是在 4-8mM 之间选择。2)模板的浓度：RT-PCR 实验既可以选用总 RNA，又可以选用 mRNA，其浓度应在 1pg-1ug 之间选择。对于低模板浓度，可以增加适量的 MS2 或用alternativeRNA 作为载体进行测定。3)对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。QIAGEN 的 QuantiTect 引物对 QuantiTect Primer Assays引物设计，特别是 SYBR Green 方法做 real-time RT-PCR 的引物设计是比较考功夫的引物的专一性是结果特异性的最重要保障，当需要选择较

30、小的片断而非全长基因来做定量时，自行设计引物如何保证专一性和特异性有时不免令人头疼。QuantiTect Primer Assays 是 Qiagen 特别为 SYBR Green 方法做 real-time RT-PCR 而设计的引物对，涵盖人类、大鼠、小鼠等 7 个物种基因组上 13万多个基因，这些已经反复优化、经过预证的引物对能 100%保证提供高度特异和灵敏的结果，最大的好处就是你可以节约很多时间，不必再为自行设计引物而头疼，避免由于引物设计不当、或引物合成/纯化问题而得不到理想的结果、以及避免由此而导致的精力、时间和实验材料的浪费有的时候时间就是金钱，由于总是得不到理想的结果而不得不

31、反反复复地重复实验，这种苦头大家或多或少都有体会吧？QuantiTect Primer Assays 经过 Qiagen 专家反复验证，保证不会出现引物二聚体，能保证得到的结果在相当宽范围内的保持良好的线性关系，得到比探针法更灵敏的结果，那就不需要考虑更加昂贵的荧光探针法了，所以从某个角度来说，购买预证引物能省时省事，也能省钱的。用来快速做基因表达分析、基因沉默验证或者是 DNA 芯片结果的验证非常合适。当然，Qiagen 预证引物对的合成质量、纯度你都可以绝对信赖，如果能打个较大的折扣，那么近千元一对的预证引物（足够做 200 次 50ul 反应，或者 500 次 20ul 反应）折半下来就

32、不那么吓人了，毕竟是专家预证过的引物啊。到底是省事省时还是省钱？如何权衡得失还要自己考虑。数据库提供方便的检索界面和详细的基因特异性产品的信息，包括转录本的信息和图示，引物扩增区段的位置和扩增区段的长度。另外，针对于同一基因的探针和也可以在同一个数据库里面找到。值得注意的是，这个 Primer 的设计针对于 mRNA 检测，不会检测到，所以即便样本没有经过处理也没有问题。当然，如果是单外显子基因，或者有假基因存在的话，检测到是不可能通过 primer 的设计来避免的。设计荧光定量的引物其实和普通的引物设计是一样的，只是注意要片段控制在 100-250 之内，并且特异性要强，还有就是最好跨内含子

33、设计引物，这样一般不会有问题的。你的没起峰，应该是引物没设计好！如果你们用的是 ABI 公司的仪器，他们有购机赠送的软件，Primer Express，用来设计定量 PCR 的引物是蛮好的，这个软件只要买 ABI 定量 PCR 仪都会送的，单独买是很贵的，所以要好好利用资源，不要浪费呢！如果没有的话，可以用 primer5 或者 6。个人觉得，跟 primer 同一个公司开发的AlleleID 软件也是挺好用的，AlleleID 有不同的设计程序，可以让你选择是设计Taqman 探针和引物、SYBY Green 的引物，还是分子信标等方法用的引物，里面的默认参数设置都是针对不同方法的要求，例如用 SYBY Green 法的引物，设计出来再用其他的软件分析，发现确实不容易产生引物二聚体，实际做实验的效果也是挺理想的。