1、PCR 引物设计的 11 条黄金法则2006-7-21 8:15:42 信息来源：本站原创 PCR 引物设计的 11 条黄金法则 生物谷 网站 http:/ PCR 引物设计的 11 条黄金法则 1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如 DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在 1530 碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 7
2、4，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物 GC 含量在 40%60%之间， Tm 值最好接近 72。 GC 含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。另外，上下游引物的 Tm 值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于 Tm 值 510。若按公式 Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm 为 5580，其 Tm 值最好接近 72以使复性条件最佳。 4.引物 3端要避开密码子的第 3 位。 如扩增编
3、码区域，引物 3端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物 3端不能选择 A，最好选择 T。 引物 3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为 A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于 A、T 之间，所以 3端最好选择 T。 6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚
4、嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免 3 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G 值不要过高（应小于 4.5kcal/mol）。否则易
5、导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。8. 引物 5 端和中间G 值应该相对较高，而 3 端G 值较低。 G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G 值越大，则双链越稳定。应当选用 5 端和中间G 值相对较高，而 3 端G 值较低（绝对值不超过 9）的引物。引物 3 端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。（不同位置的G 值可以用 Oligo 6 软件进行分析） 9.引物的 5端可以修饰，而 3端不可修饰。 引物的 5 端决定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰
6、而不影响扩增的特异性。引物 5 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从 3 端开始的，不能进行任何修饰。3 端也不能有形成任何二级结构可能。10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如 RNAstructure）可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于 58.6l kJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用
7、 7-deaza-2-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。 11. 引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的 PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。做 Real Time 时,用于 SYBR Green I 法时的一对引物与一般 PCR 的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要
8、求： 1)避免重复碱基，尤其是 G. 2)Tm=58-60 度。 3）GC=30-80%. 4)3端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C. 5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。 6)PCR 扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在 80-250bp 之间都可；80150 bp 最为合适（可以延长至 300 bp）。 7)引物的退火温度要高，一般要在 60 度以上； 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组 DNA 污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组 DNA 污
9、染的影响。 至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS 都应该可以的。 做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备-寻找合适的引物非常不容易。 关于 BLAST 的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在 GENEBANK 中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。生物谷网站 http:/ 浅谈 PCR 方法中常
10、见的污染问题及对策信息来源：山东畜牧杂志 更新时间：2005-11-11 9:23:17 浅谈 RT-PCR 实验方法中常见污染问题及对策河南出入境检验检疫局技术中心 李轲反转录-聚合酶链反应（RT-PCR ）是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定，所以近年来 RT-PCR 技术被广泛应用于人和动物的多种传染病早期诊断。笔者一直从事实验室动物疫病检测工作，现就应用RT-PCR 实验方法过程中出现的一些常见污染问题做如下论述，仅共同行参考和探讨。 RT-PCR
11、 实验有三步：提取 RNA、反转录（RT ）、PCR 扩增及扩增产物分析，在这一过程中，最令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性。污染原因主要有以下几个方面： 1、样品间的交叉污染收集样品的容器最好使用一次性的，如重复使用，应在使用前应于 180的高温下干烤 6 小时或更长时间；样品存放时要密封严实，以防外溢造成相互间的交叉污染；样品在提取过程中离心管及吸样枪头最好使用一次性的，以免不同实验样品间相互污染；由于吸样枪污染会导致样品间的污染，也是一个值得注意的问题，由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取时要十分小心，吸时要慢，吸取尽量一次性完
12、成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染；同时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管，开盖时也容易造成气溶胶污染。若产生气溶胶较多，会造成环境污染，不仅会导致实验失败，而且也会损害操作人员身体健康，因此每次实验完毕都要及时清理实验台面，用 0.5%次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。 2、RT-PCR 本身使用的试剂污染在试剂配制过程中，由于加样枪、容器及其它溶液被污染。因此所有试剂都应尽量小量分装，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外RT-PCR 试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进行台面消毒和紫外线照射消毒。 3、扩增产物的污染这是实验中最常见的问题，极微量的扩增产物污染就
13、可造成假阳性，每次实验完后，扩增产物都要及时密封后处理。在做 RT-PCR 实验时，一般都应设阳性对照，操作不慎，污染可能性很大，因而当某一 RT-PCR 试剂经自己使用稳定，检验人员经验丰富心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照，或间隔性设阳性对照，以减少污染机会。 4、操作人员污染只要存在少量的 RNA 酶就会引起 RNA 的降解，从而影响结果的准确性，RNA 酶可存在操作人员手汗、唾液中，也可灰尘中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成实验失败，因此操作人员应戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换，。设置 PCR 操作专用实验室，所用实验用具应为专用，并合理分隔实验室
14、，将样品的提取、配制 RT-PCR 反应液、PCR 循环扩增等步骤分室进行，实验前应将实验室及实验人员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的 DNA 或 RNA。任一种科学的实验方法都有其自身完善和发展的过程，RT-PCR 方法也不例外，在检测质量能保证的情况下，若能简化样品提取步骤或缩短其时间，减少扩增循环次数，都能对防止污染有利。总之，RT-PCR 不管从特异性方面还是从灵敏性方面讲都具有难以匹敌的优势，结果的可靠性和可信性应该是最好的，是较具权威性的检测方法，我们期待着它能尽快地自身完善和发展。PCR 污染与对策信息来源：本站原创 更新时间：2005-2-23 16:20:00 PCR 反
15、应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.污染原因(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.(二)PCR 试剂的污染:主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染.(三)PCR 扩增产物污染.这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题.因为 PCR 产物拷贝量大(
16、一般为 1013 拷贝/ml)，远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的 PCR 产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性.还有一种容易忽视，最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题 .(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆 质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细
17、胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染.对照试验1.阳性对照:在建立 PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设有 PCR 阳性对照，它是 PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳 性对照，其含量宜低不宜高(100 个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一 PCR试
18、剂经自己使用稳 定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.2.阴性对照:每次 PCR 实验务必做阴性对照.它包括标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.试剂 对照:在 PCR 试剂中不加模板 DNA 或 RNA，进行 PCR 扩增，以监测试剂是否污染.3.重复性试验4.选择不同区域的引物进行 PCR 扩增防止污染的方法一 污染的预防进行 PCR 操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的 PCR 污染或杜绝污染的出现。（一）划分操作区：目前，普通 PCR 尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无
19、论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；2. PCR 扩增区，包括反应液的配制和 PCR 扩增；3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备PCR 扩增产物分析产物处理。切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。（二）分装试剂：PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的 DNA 和其他来源的 DNA：1 PCR
20、 用水应为高压的双蒸水；2 引物和 dNTP 用高压的双蒸水在无 PCR 扩增产物区配制；3 引物和 dNTP 应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。(三) 实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；2. 使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心
21、溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证 PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本 DNA 的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少 PCR 操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是 PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；8.
22、 重复实验，验证结果，慎下结论。二 追踪污染源如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。（一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为 PCR 敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括 PCR 体系中各试剂的时机对照，即包括 PCR 反应所需的全部成分，而不加模板
23、DNA，这对监测试剂中 PCR 产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。（二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。 环境污染中常见的污染源主要有：1. 模板提取时真空抽干装置；2. 凝胶电泳加样器；3. 电泳装置；4. 紫外分析仪；5. 切胶用刀或手术刀片；6. 离心机；7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；此时可用擦拭实验来查找可疑污染源
24、。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml 去离子水浸泡；3）取 5ml 做 PCR 实验；4）电泳检测结果。8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中 PCR 产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。三污染处理（一）环境污染1. 稀酸处理法：对可疑器具用 1mol/L 盐酸擦拭或浸泡，使残余 DNA 脱嘌呤；2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择 254/300nm，照射 30min 即可。需要注意的是，选择UV 作为消除残留 PCR 产物污染时，要考虑 PCR 产物
25、的长度与产物序列中碱基的分布， UV 照射仅对 500bp 以上长片段有效，对短片段效果不大。UV 照射时，PCR 产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是 DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体，且 UV 照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于 UV 波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长 DNA 链上，形成二聚体缺陷的数量少于 0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 链间与链内的交联和 DNA 断裂等）均可终止 Taq DNA 聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.1
26、3/碱基）在 DNA 分子上随机分布，一个 500bp 片段的 DNA 分子链上将有 32 处损伤位点，那么，105 个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果 100bp的片段，每条链上仅有 6 处损伤，105 个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是 UV 照射有一定的片段长度限制的原因。（二）反应液污染可采用下列方法之一处理：1. DNase I 法：PCR 混合液（未加模板和 Taq 聚合酶）加入 0.5U DNase I，室温反应 30 min 后加热灭活，然后加入模板和 Taq 聚合酶进行正常 PCR 扩增。该方法的优点是不需要知道污染 DNA 的序列；2. 内切酶法
27、：选择识别 4 个碱基的内切酶（如 Msp I 和 Taq I 等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用 1h 后加热灭活进行 PCR；3. 紫外照射法：未加模板和 Taq 聚合酶的 PCR 混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述 UV 照射法；4. g 射线辐射法：1.5kGy 的辐射可完全破坏 0.1ng 基因组 DNA，2.0 kGy 可破坏 104 拷贝的质粒分子，4.0 kGy 仍不影响 PCR，但高于此限度会使 PCR 扩增效率下降。引物可受照射而不影响 PCR，g 射线是通过水的离子化产生自由基来破坏 DNA 的。（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法由于
28、UV 照射的去污染作用对 500bp 以下的片段效果不好，而临床用于检测的 PCR 扩增片段通常为 300bp 左右，因此 UNG 的预防作用日益受到重视和肯定。1. 原理：在 PCR 产物或引物中用 dU 代替 dT。这种 dU 化的 PCR 产物与 UNG 一起孵育，因 UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的 N-糖基键，可除去 dU 而阻止 TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含 dU 的模板无任何影响。UNG 可从单或双链 DNA 中消除尿嘧啶，而对 RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。2. dUTP 法：用 dUTP 代替 dTTP，使产物中
29、掺入大量 dU。在再次进行 PCR 扩增前，用 UNG 处理 PCR混合液即可消除 PCR 产物的残留污染。由于 UNG 在 PCR 循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含 dU 的新的 PCR 产物。3. dU 引物法：合成引物时以 dU 代 dT，这样 PCR 产物中仅 5端带 dU。UNG 处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb 以上）的扩增用 dUTP 法效率较用 dTTP 低，而用 dU 法就可克服这一缺点。dU 引物最好将 dU 设计在 3端或近端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG 处理可以和 PCR 扩增在同一个反
30、应管内进行；由于扩增产物中有大量 dU 存在，可彻底消除污染源。5. 需注意的是掺入 dUTP 的 DNA 不应对产物的任何操作有影响，在进行 PCR 产物克隆时，应该转化 UNG-（UNG 缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌 UNG 消化掉。（四） 固相捕获法用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链 RNA 探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非 RNA 探针杂交区域。第 2）步的漂洗后可用 PCR 检测以确定标本是否被扩增产
31、物或重组质粒污染。（五）RS-PCR 法（RNA-specific PCR）也称为链特异性 PCR，主要指用于 RNA 模板的特异性 PCR 法，该法可明显降低假阳性而不影响 PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的 3端（A 区）有 2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5端 2 0 个核苷酸（C 区）为附加修饰碱基。与 mRNA 逆转录后，经超速离心使 cDNA 与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链 cDNA 为模板合成第二链 cDNA，以后的 PCR 循环中用逆转录引物的 B 区和引物 C 进行扩增加尾 cDNA，而污染的 DNA 或质粒 DNA 才不会被扩增。（六）抗污染引物法该对引物扩增时通过病毒 DNA 克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒 DNA 才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。（http:/）
