1、自从 1985 年 Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一1，而引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在 PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行 PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。 引物设计的原则 引物设计有 3
2、条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应(即错配)。 具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列 Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用 G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming s
3、ite）的引发效率，引物及产物的 GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应2。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物 3端出现 3 个以上的连续碱基，如 GGG 或 CCC，也会使错误引发机率增加2。 3. 引物 3端的末位碱基对 Taq 酶的 DN
4、A 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基，因此应当避免在引物的 3端使用碱基 A34。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR 反应失败。5端序列对 PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物2。 4. 引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大25。 5. 引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在 Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nea
5、rest neighbor method) 67。 6. G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3端 G 值较低（绝对值不超过 9），而 5端和中间G 值相对较高的引物。引物的 3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应6。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行8。 8. 对引物的修饰一般是在 5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。 值得一提的是，各种模板的引物设计难
6、度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的 PCR 因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 引物的自动搜索和评价分析 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit
7、”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。 Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源性分析功能（ ），
8、但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等。 有时需要根据一段氨基酸序列反推到 DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的 18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推 DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板 DNA 的
9、来源以相应的遗传密码规则转换 DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。 2. 使用步骤及技巧 “Premier”软件启动界面如下
10、： (转载的时候就没有图) 其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。 进行引物设计时，点击按钮，界面如下： 进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜
11、索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或 Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按，随之出现的 Search Progress 窗口中显示 Search
12、 Completed 时，再按，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为 100，即各指标基本都能达标（如下图）。 点击其中一对引物，如第 1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示： 该图分三部分，最上面是图示 PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引
13、物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。 在需要对引物进行修饰编辑时，如在 5端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至 DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之，“Premier”有优秀的引物自动搜
14、索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易 使用，是一个相当不错的软件。 Oligo 6.22 使用技巧简介 1. 功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和G 图；Oligo 6.22 的界面更复杂，出现三个图，加了个 Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。 2. 使用（以 Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下： 图中显示的三个指标分别为 Tm、G 和 Frq，其
15、中 Frq 是 6.22 版本的新功能，为邻近 6 至 7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的 cascade 排列方式不太方便，可从 windows 菜单改为 tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如 Frq，这样界面的结构同于 Oligo5.0，只是显示更清楚了。 经过 Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击 Tm 图块上左下角的 Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上
16、，只是按钮变成 Lower。G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的G 值在 5端和中间值比较高，而在 3端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取 72附近为佳，5到 3的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用 3端 Frq 值相对较低的片段。 当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是 3端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，
17、越不符合要求。一般的检测（非克隆）性 PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过 4.5 为好。 当然，在设计克隆目的的 PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种 PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为 GC 含量，以 45-55为宜。有一些模板本身的 GC 含量偏低或偏高，导致引物的 GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游
18、引物的 GC 含量以及 Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果 PCR 的模板不是基因组 DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行 False priming site 的检测。这项检查 可以看出引物在非目的位点引发 PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的 PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过 100 为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为 450 以上，而在错误位点的引发效率为 130，那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测，按 Alt+P 键弹出 PCR 窗
19、口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。 除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由 Whitehead Institute 开发的“Primer 3”等（本网站 http:/210.72.11.60 已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该软件的独特之处在于，对全基因组 PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组 PCR 的用户试用。
