1、 1 / 6实验四 逆转录 PCR (RT-PCR)【实验目的】1了解用逆转录 PCR 法获取目的基因的原理。2学习和掌握逆转录 PCR 的技术和方法。【实验原理】聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增 DNA 序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经 25-35 轮循环就可使模板 DNA 扩增达 106 倍。RT-PCR 将以RNA 为模板的 cDNA（complement DNA）合成（即 RNA 的反转录（RT，reversetranscription） ） ，同c
2、DNA 的 PCR 结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和 cDNA 克隆的快速灵敏的方法。由于 cDNA 包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此 RT-PCR 成为目前获得目的基因的一种重要手段。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中 RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列。RT-PCR 比其他包括 Northern 印迹、RNase 保护分析、原位杂交及 S1 核酸酶分析在内的 RNA 分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR 的基本原理（图 4.1） 。首先是在逆转
3、录酶的作用下从 RNA 合成 cDNA，即总 RNA 中的mRNA 在体外被反向转录合成 DNA 拷贝，因拷贝 DNA 的核苷酸序列完全互补于模板 mRNA，称之为互补 DNA（cDNA） ；然后再利用 DNA 聚合酶，以 cDNA 第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量的 cDNA 或目的片段。在 RT 时，有 3 种引物可选择 （表 4.1) 。用 1）和 2）方法，理论上是扩增的所有的 cDNA，还要用此产物做 PCR 的模板继续扩增。如果用 3）方法，先要去 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov 查它的序列，并用 oligo 等软
4、件设计引物。RT-PCR 可以一步法或两步法的形式进行。两步法 RT-PCR 比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的 mRNA 时比较有用。在两步法 RT-PCR 中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出 1/10 的反应产物进行 PCR。而一步法 RT-PCR 具有其它优点（表 4.2） ，cDNA 合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度，最低可以达到 0.1pg 总 RNA，因为整个 cDNA 样品都被扩增。对于成功的一步法 RT-PCR，一般使用基因特异性引物(GSP)起始 cDNA 的合成
5、。由图 4.1 不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的 cDNA。这种方法经常用于获取 5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的 RNA 模板获得 cDNA。为了获得最长的 cDNA，需要按经验确定每个 RNA 样品中引物与 RNA 的比例。随机引物的起始浓度范围为 50 到 250ng 每 20l 反应体系。因为使用随机引物从总 RNA 合成的 cDNA 主要是核糖体 RNA，所以模板一般选用 poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞 mRNA 3端所发现的 po
6、ly(A)尾杂交。因为 poly(A)+RNA 大概占总 RNA 的 1%到 2，所以与使用随机引物相比，cDNA 的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对 RNA 和引物的比例及 poly(A)+选择进行优化。建议每 20l 反应体系使用 0.5g oligo(dT)。oligo(dT)12-18 适用于多数 RT-PCR。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。 GSP 是反义寡聚核苷，可以特异性地同 RNA 目的序列杂交，而不象随机引物或 oligo(dT)那样同所有 RNA 退火。用于设计 PCR 引物的规则同样适用于逆转录反应 G
7、SP 的设计。GSP 可以同与 mRNA 3最末端退火的扩增引物序列相同，或 GSP 可以设计为与反向扩增引物的下游退火。已经制备好的双链 cDNA 和一般 DNA 一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需有2 / 6适当的接头(Linker) ，接头可以是在 PCR 引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经 PCR 扩增后再克隆入相应的载体；也可以利用末端转移酶在载体和双链 cDNA 的末端接上一段寡聚 dG 和 dC 或 dT和 dA 尾巴,退火后形成重组质粒, 并转化到宿主菌中进行扩增。本实验是要从小鼠肝脏组织中获取 Fas 配体基因， Fas 配体(FasL)是一分子量约为 40u
8、 的 II 型跨膜糖蛋白，属 TNF 家族成员。活化的 T 细胞可表达 Fas 和 FasL，并通过 Fas/FasL 系统介导细胞凋亡作用，保持机体免疫系统的自稳态。近年研究发现在部分癌细胞中 FasL 表达增强，并与肿瘤的复发转移有关。我们采用 RT-PCR 方法克隆 FasL 全长 cDNA 并构建其表达载体，可以为进一步研究 FasL的功能提供条件。在上下游引物的 5端分别加上了限制酶切位点及其保护碱基（即 Hind III 和BamH I） ，以便可以通过双酶切将目的片段定向的克隆到原核表达载体 pGFPUv 上（附录图 4.3） 。为了便于后续实验可以用金属螯和层析的方法分离和纯化
9、目的蛋白，我们改造了 pGFPUv，在其上加了 6His 标签。3 / 6【试剂与器材】（一）试剂1.总 RNA（或 mRNA）2.RNA 酶抑制蛋白（RNase Inhibitor） ：40 U/mL3.dNTP 混合物 (各 10 mM)4.oligo(dT)12-18：2.5 mol/L5.10*逆转录合成缓冲液（10RT buffer）：250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3)，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl26.AMV 逆转录酶 5u/L7.基因特异性 5和 3引物各 20 mol/L 8.Tap DNA 聚合酶 5u/L9.10*PCR 缓
10、冲液： 500mmol/L KCl，100mmol/L TrisCl，在 25下，pH9.0，1.0% Triton X-100，15mmol/L MgCl2。（二）器材1）PCR 仪，2）PCR 管，3）微量移液器【操作方法】（一）逆转录：1)建立 RT 反应体系：4 / 62)涡旋混匀，42反应 1 小时，95加热 5 分钟，然后置于冰上。（二）PCR 扩增：1)建立 PCR 反应体系：2)将上述反应体系涡旋混匀, 按下列程序运行循环：step2-4 运行 30 个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。（三）取 10-20uL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，余下的 PCR 产物
11、-20保存。【注意事项与提示】1.逆转录反应过程，需建立无 RNAase 环境，以避免 RNA 的降解。2.成功的逆转录反应决定于高质量的模板 RNA。高质量的 RNA 至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如 EDTA 或 SDS。此外，RT-PCR 所遇到的一个潜在的困难是 RNA 中沾染的基因组 DNA。使用较好的 RNA 分离方法，如 Trizol Reagent，会减少 RNA 制备物中沾染的基因组 DNA。因此在进行PCR 反应时应该对每个 RNA 模板进行一个无逆转录的对照反应，以确定扩增出来的片段是来自基因组 DNA 还是 cDNA。在无逆转录时所得到的 PCR 产物来源于基
12、因组。3.RT-PCR 的起始模板可是总 RNA 或 mRNA，都可以检测到扩增结果（如下图） 。另外，分离 mRNA 会导致样品间 mRNA 丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有基因时，使用 mRNA 会增加检测的灵敏度。5 / 64.在逆转录反应中经常加入 RNA 酶抑制蛋白以增加 cDNA 合成的长度和产量。RNA 酶抑制蛋白要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如 DTT）存在的条件下加入，因为 cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解 RNA 的 RNase。RNA 酶抑制蛋白仅防止 RNase A，B，C 对RNA 的降解，并不能防
13、止皮肤上的 RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心试验者的手上Rnase 对样品的污染。5.较高的保温温度有助于 RNA 二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数 RNA 模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将 RNA 和引物在 65保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用经过改良的耐高温逆转录酶， 如：Invitrogen 公司的 ThermoScript 逆转录酶，使逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。而且适当提高逆转录保温温度，可增加 RT-PCR 的特异性。6.建
14、立反应体系时，加完其它反应物后，才加模板 DNA 和 Taq DNA 聚合酶；然后将全部反应物涡旋混匀；上 PCR 仪前加矿物油封盖或设热盖。7.PCR 反应的循环数一般 25-30 次就足够了，过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的浪费。复性温度的计算，一般是在引物的 Tm 值上下浮动，Tm =2（A+T ）+4 （G+C ） 。适当提高复性温度可提高PCR 扩增的特异性。8.不管是反转录反应还是 PCR 反应都应先调制试剂的 Master Mix (包括 RNase Free dH2O、缓冲液、dNTP Mixture 等)，然后分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂的体积更准确，减少试剂
15、的损失，避免重复分取同一试剂，同时也可以减少实验操作造成的误差。而且分装试剂时务必用新 Tip，以防止样品间的污染。 9.AMV、RNase Inhibitor、Taq 等酶类，要轻轻地混匀，避免起泡。分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶类务必在实验前从-20取出，使用后立即放回-20保存。 10.最佳的 PCR 条件，因 PCR 扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先做 Control 反应，以确定最佳的 PCR 条件。为延长 PCR 仪的使用寿命，应尽可能缩短 PCR 仪 4保存的时间，尽量避免 4过夜的情况。Lane 1：总 RNA 的 RT
16、-PCR 产物（人细胞调亡因子 TF15 基因）6 / 6Lane 2： mRNA 的 RT-PCR 产物，人细胞调亡因子 TF15 基因Lane 3： 100bp marker【实验安排】1第一天：试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去 RNase 处理（0.1%DEPC 浸泡或高温干烤） 。2第二天：进行（一）逆转录和（二）PCR 扩增。3第三天：进行（三）琼脂糖凝胶电泳检测。4为了保证实验质量，最好能将总 RNA 提取、mRNA 的分离纯化、RT-PCR 和 cDNA 文库构建实验安排在连续的时间内进行。【实验报告要求与思考题】1RT-PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果；2如何提高 RT-PCR 的灵敏度和特异性？
