1、RT-PCR原理与实验步骤一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个 mRNA 存活 4d，可以合成 105个丝心蛋白） 共合成 109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的 mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR 技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A.变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链
2、DNA；B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C.延伸：在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2存在下，退火引物沿 5 3方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。3、逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链； 2、 Rnase 水解活性：水解 RNA:DNA 杂合体中的 RNA； 3、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链
3、cDNA. 二、RT-PCR 的准备：1.引物的设计及其原则： 1) 引物的特异性决定 PCR 反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2) 引物设计原则的把握引物设计原则包括 :a、引物长度 :一般为 1530bp ，引物太短会影响 PCR 的特异性，引物太长 PCR 的最适延伸温度会超过 Taq 酶的最适温度，也影响反应的特异性。 b
4、、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现 3 个以上的单一碱基。GC 含量（Tm 值）：40 60 ，PCR 扩增的复性温度一般是较低 Tm 值减去 510 度。 c、 3 端要求：3 端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是 A 时错配的引发效率最低，G 、C 居中间，因此引物的 3端最好选用 A、G、C 而尽可能避免连续出现两个以上的 T。 d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于 4 个连续碱基互补， 3端不应超过2
5、 个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8 个的互补碱基存在。 g、5端无严格限制：5末端碱基可以游离，但最好是 G 或 C，使 PCR 产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如 Primer5.0，Oligo6.0 等对于这些条件都可以自行设置。 2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP 管之类事先都需经过 0.1%DEPC水浸泡处理，除去 RNA 酶，防止操作过程中 RNA 降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活 DEPC）。3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、
6、经 DEPC 处理并高压的水。 三、RNA 的提取方法RTPCR 中从细胞分离的 RNA 的质量至关重要，包括 RNA 的纯度和完整性。RNA 分离的最关键因素是尽量减少 RNA 酶的污染。但 RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性 RNA 酶外，环境中也存在大量 RNA 酶。因此在提取 RNA 时，应尽量创造一个无 RNA 酶的环境，包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制内源性 RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶，通过 RNA 酶的阻抑蛋白Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性 RNA 酶。 RNA 的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤
7、来源：生物谷 访问量：3688评论(0)分享 1一、实验目的掌握植物总 RNA 非变性胶电泳的原理和方法。二、实验原理RNA 电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用 1.0%-1.4%的凝胶，不同的 RNA 条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA 的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定 RNA 分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总 RNA 样品完整性时，配制普通的 1%琼脂糖凝胶即可。三、实验材料、器具及药品蘑菇的总 RNA 溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE 电泳缓冲液，0.
8、5g/ml 溴化乙锭（EB）10X 载样缓冲液。四、实验步骤（1）用 1TAE 电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加 1TAE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总 RNA 样品 4l 于封口膜上。在实验台上再加入 5l 1TAE 电泳缓冲液及 1l 的 10X 载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3）打开电源开关，调节电压至 100V，使 RNA 由负极向正极电泳，约30min 后将凝胶放入 EB 染液中染色 5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察 RNA 电泳结果。RNA 的变性琼脂糖凝胶检测试剂：（1）MOPS 缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷
9、磺酸（ MOPS） (Ph7.0) ，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。（2）上样染料： 50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。（3）甲醛。（4）去离子甲酰胺。 v 电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）水冲洗乙醇干燥3%H2O2 灌满室温放置 10 分钟0.1%DEPC 水冲洗。操作：（1） 将制胶用具用 70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。（2） 配制琼脂糖凝胶。称取 0.5g 琼脂糖，置干净的 100ml 锥形瓶中，加入 40ml 蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶凉至 60-70 ，依次向其中加入 9ml 甲醛、 5ml 10X MOPS 缓冲液和0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。灌制琼脂糖凝胶。（3） 样品准备： 取 DEPC 处理过的 500ul 小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS 缓冲液 2ul，甲醛 3.5ul,甲酰胺（去离子）10ul，RNA 样品 4.5ul,混匀。 将离心管置于 60水浴中保 10 分钟，再置冰上 2 分钟。 向管中加入 3ul 上样染料，混匀。（4）上样。（5）电泳：电泳槽内加入 1XMOPS 缓冲液，于 7.5V/ml 的电压下电泳。（6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。
