1、1RT-PCR实验步骤实验 材料： 水稻叶片的RNA。实 验原 理 ： 目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不能直接扩增。mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增，这种在mRNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR。RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。本实验以水稻叶片RNA为材料，检测-actin基因的表达。实验中设定2个阴性对照：一个不加模板RNA，另一个不加反转录酶，主要是消除DNA及PCR试剂方面引起的假阳性；同时以叶片DNA为阳性对照，检验PCR试剂和扩增过程是否有问题。实验
2、 步骤：RNA抽提1. 用TRIzol 试剂提取植物总RNA。2. 将总RNA稀释到终浓度1g/l 。3. 在0.5ml 的无菌eppendorf 管中分别加入:TotalRNA0.5-gRNase-freeDNaseI l( u/l)10DNaseIbuffer1lDEPC处理的ddH2O5l4.37保温15min, 然后70保温10min. 。反转 录反应1. 加1l500g/mloligo(dT)15primer, 涡旋混合，简单离心。22.在65加热混合物10分钟, 然后室温10分钟，再分别加入下列试剂：5第一链缓冲液4l、0.1MDTT2l、10mMdNTP1l3.涡旋混合后，简单离
3、心，37水浴2min.。4. 加2l200U/ml 的M-MLV反转录酶。轻缓混合，37保温1h。其总体积应为20l。5.70加热15min终止反应，然后加20l 的ddH2O，cDNA第一链可作为模板用于PCR扩增。6. 若要去除与cDNA互补的RNA，可加1l(2units)的RNaseH，然后37保温20min。PCR扩增1. 在冰上混合加入下列试剂：cDNA第一链1lTaKaRaExTaq(5u/1l)0.5l10ExTaqbuffer5ldNTPmixture(2mM)4lPrimerF(10mM)2lPrimerR(10mM)2lddH2O35.5l2.PCR反应程序Step194
4、3min1Step2941min，601min，721min，30-40CyclesStep3725min1Step44forever3. 以-actin作为每个RT-PCR的内在标准，以水代替反转录酶来检测RT-PCR中的DNA污染。3所使 用试剂 ： 5第一链缓冲液(GIBCOPartNo.Y00146)100mMDTT(GIBCOPartNo.Y11147)200U/lM-MLVReversetranscriptase(GIBCOPartNo.28025-021)500g/mloligo(dT)15primer(PromegaCat. No. C110A9362612)10mMdNTP混合物RNase-freeDNaseI(TaKaRaCodeNo. 2215CA)5U/lExTaqpolymerase和10buffer(TaKaRaCodeNo. RR001DCA)10MspecificPrimerFandRSterileddH2O
