1、红外分光光度法1 简述化合物受红外辐射照射后，使分子的振动和转动运动由较低能级向较高能级跃迁从而导致对特定频率红外辐射的选择性吸收，形成特征性很强的红外吸收光谱，红外光谱又称振-转光谱。红外光谱是鉴别物质和分析物质化学结构的有效手段，已被广泛应用于物质的定性鉴别、物相分析和定量测定，并用于研究分子间和分子内部的相互作用。习惯上，往往把红外区分为 3 个区域，即近红外区（128004000 -1cm，0.782.5um） ，中红外区（4000400 -1cm，2.525um）和远红外区（40010 -1cm，251000um） 。其中中红外区是药物分析中最常用的区域。红外吸收与物质浓度的关系在一
2、定范围内服从于朗伯 比尔定律，因而它也是红外分光光度法定量的基础。红外分光光度计分为色散型和付里叶变换型两种。前者主要由光源、单色器（通常为光栅） 、样品室、检测器、记录仪、控制和数据处理系统组成。以光栅为色散元件的红外分光光度计，波数为线性刻度，以棱镜为色散元件的仪器以波长为线性刻度。波数与波长的换算关系如下：付里叶变换型红外光谱仪（简称 FTIR）则由光学台（包括光源、干涉仪、样品室和检测器） 、记录装置和数据处理系统组成，由干涉图变为红外光谱需经快速付里叶变换。该型仪器现已成为最常用的仪器。2 红外分光光度计的检定所用仪器应根据中华人民共和国国家计量检定规程“JJG68190 色散型红外
3、分光光度计”和中国药典附录规定，并参考仪器说明书，对仪器定期进行校正检定。目前国家尚未颁布付里叶变换红外光谱仪的计量检定规程，但这类仪器可参照色散型红外分光光度计的有关检定规程和有关药典规定进行检定。2.1 波数准确度2.1.1 波数准确度的允差范围 付里叶变换红外光谱仪在 3000cm-1附近的波数误差应不大于5cm-1，在 1000cm-1附近的波数误差应不大于1cm -1。2.1.2 波数准确度检定方法2.1.2.1 以聚苯乙烯膜校正 按仪器使用说明书要求设置参数，以常用的扫描速度记录厚度为 50um 的聚苯乙烯膜红外光谱图。测量有关谱带的位置，其吸收光谱图应符合药品红外光谱集所附聚苯乙
4、烯图谱的要求，并与参考波数（见表 1）比较，计算波数准确度。2.1.2.2 以液体池用液体茚校正 液体茚在 3900690 -1cm 范围内有较多的吸收峰可资比较，适于测定中等分辨率的仪器。一般需用适当液层厚度的固定厚度密封液体池，选用液体池的窗片材料应能保证在测量波数范围内有良好的红外光透过率，窗片应有良好的光洁度和平面平行度，注样品时将液体池放在一楔形板上，打开 2 个进样孔塞，把样品用专用注射器从下部进样孔缓缓注入。同时观察池内液面缓缓上升而不夹带气泡，至液体在上进样孔内接近满溢时，取下注射器，先盖好下进样孔塞，再盖上上进样孔塞，吸去外溢液体后即可在仪器上测定吸收光谱，其主要谱带见表 2
5、。2.2 波数重现性 用与 2.1 波数准确度测量相同的仪器参数，对同一张聚苯乙烯膜进行反复重叠扫描。一般扫描 35 次。从扫描所得光谱测定波数的重现性。测得的各吸收峰的重现性应符合国家计量检定规程 JJG681-90 的要求。2.3 分辨率 以聚苯乙烯膜检定。色散型红外仪用常规狭缝程序，通常的扫描速度，或以较窄的狭缝程序用较慢的扫描速度，记录聚苯乙烯的图谱。付里叶红外仪设置于 2cm-1分辨率和适宜的扫描次数，依法记录光谱图。在 31102850cm -1范围内，应能显示 7 个吸收带，其中峰 2851cm-1与谷 2870cm-1之间的分辨深度应不小于 18透光率；又峰 1583cm-1与
6、谷1589cm-1之间的分辨深度应不小于 12透光率。仪器的标称分辨率，应不低于 2cm-1。2.4 100线平直度 调节 100控制旋钮，使记录笔置于 95透光率处，以快速扫描速度扫描全波段，其 100线的偏差应小于 4透光率。2.5 噪声 调节 100控制旋钮，使记录笔置于 95透光率处，在 1000cm-1处定波数连续扫描 5 分钟，其最大噪声（峰-峰值）应小于 1透光率。2.6 其它 杂散光水平和透光率准确度检查，因需要特殊器件，且对药品测定影响不大，故不作硬性要求。详见检定规程 JJG681-90。3 红外光谱测定操作方法红外光谱测定技术分两类。一类是指检测方法，如透射、衰减全反射、
7、漫反射、光声及红外发射等；另一类是指制样技术。在药物分析中，通常测定的都是透射光谱，采用的制样技术主要有压片法、糊法、膜法、溶液法、衰减全反射和气体吸收池法等。3.1 压片法 取供试品约 11.5mg，置玛瑙研钵中，加入干燥的溴化钾或氯化钾细粉约200300（与供试品的比约为 200:1）作为分散剂，充分研磨混匀，置于直径为 13mm 的压片模具中，使铺展均匀，抽真空约 2 分钟，加压至（0.810 6）kPa（约 810T/cm 2） ，保持压力 2 分钟，撤去压力并放气后取出制成的供试片，目视检测，片子应呈透明状，其中样品分布应均匀，并无明显的颗粒状样品。亦可采用其它直径的压模制片，样品与
8、分散剂的用量需相应调整以制得浓度合适的片子。3.2 糊法 取供试品约 5mg，置玛瑙研钵中，粉碎研细后，滴加少量液状石蜡或其它适宜的糊剂，研成均匀的糊状物，取适量糊状物夹于两个窗片或空白溴化钾片（每片约 150mg）之间，作为供试片，另以溴化钾约 300mg 制成空白片作为补偿。亦可用专用装置夹持糊状物。制备时应注意尽量使糊状样品在窗片间分布均匀。3.3 膜法 参照上述糊法所述的方法，将能形成薄膜的液体样品铺展于适宜的盐片中，使形成薄膜后测定。若为高分子聚合物，可先制成适宜厚度的高分子薄膜，直接置于样品光路中测定。熔点较低的固体样品可采用熔融成膜的方法制样。3.4 溶液法 将供试品溶于适宜的溶
9、剂中，制成 110浓度的溶液，灌入适宜厚度的液体池中测定。常用溶剂有四氯化碳、三氯甲烷、二硫化碳、己烷、环己烷及二氯乙烷等。选用溶液应在被测定区域中透明或仅有中弱的吸收，且与样品间的相互作用应尽可能小。3.5 气体吸收池法 测定气体样品需使用气体吸收池，常用气体吸收池的光路长度为10cm。通常先把气体吸收池抽空，然后充以适当压力（约 50mmHg）的供试品测定。也可用注射器向气体吸收池内注入适量的样品，待样品完全气化后测定。3.6 衰减全反射法（ATR） 取供试品适量，均匀地铺展在衰减全反射棱镜的底面上，使紧密接触，依法录制反射光谱图。本法适用于纤维、高分子聚合物等难粉碎的样品。3.7 试样的
10、制备方法除另有规定外，用作鉴别时应按照药典委员会编订的药品红外光谱集第一卷（1995 年版） 、第二卷（2000 年版）与第三卷（2005 年版）收载的各光谱图所规定的制备方法制备。具体操作技术可参见药品红外光谱集的说明。用作晶型、异构体限度检查或含量测定时，试样制备和具体测定方法均按药典各品种项下有关规定操作。4 测量操作注意事项4.1 环境条件 红外实验室的室温应控制在 1530，相对湿度应小于 65，适当通风换气，以避免积聚过量的二氧化碳和有机溶剂蒸汽。供电电压和接地电阻应符合仪器说明书要求。4.2 背景补偿或空白校正 记录供试品光谱时，双光束仪器的参比光路中应置相应的空白对照物（空白盐
11、片、溶剂或糊剂等） ；单光束仪器（常见的付里叶变换红外仪）应先进行空白背景扫描，扫描供试品后扣除背景吸收，即得供试品光谱。4.3 采用压片法时，以溴化钾最常用。若供试品为盐酸盐，可比较氯化钾压片和溴化钾压片法的光谱，若二者没有区别，则使用溴化钾。所使用的溴化钾或氯化钾在中红区应无明显的干扰吸收；应预先研细，过 200目筛，并在 120干燥 4h 后分装并在干燥器中保存备用。若发现结块，则须重新干燥。4.4 供试品研磨应适度，通常以粒度 25um 为宜。供试品过度研磨有时会导致品格结构的破坏或晶型的转化。粒度不够细则易引起光散射能量损失，使整个光谱基线倾斜，甚至严重变形。该现象在 4000200
12、0cm -1高频端最为明显。压片法及糊法中最易发生这种现象。4.5 压片法制成的片厚在 0.5mm 左右时，常可在光谱上观察到干涉条纹，对供试品光谱产生干扰。一般可将片厚调节至 0.5mm 以下即可减弱或避免。也可用金相砂纸将片稍微打毛以去除干扰。4.6 测定样品时的扫描速度应与波长校正的条件一致（快速扫描将使波长滞后） 。制成图谱的最强吸收峰透光率应在 10以下，图谱的质量应符合药品红外光谱集的要求。4.7 使用预先印制标尺记录纸的色散型仪器，在制图时应注意记录笔在纸上纵横坐标的位置与仪器示值是否相符，以避免因图纸对准不良而引起的误差。4.8 压片模具及液体吸收池等红外附件，使用完后应及时擦
13、拭干净，必要时清洗，保存在干燥器中，以免锈蚀。4.9 用于制剂红外鉴别时，在品种正文中必须详细规定样品的前处理方法，如辅料干扰不能完全排除，可规定待测成分的 35 个特征谱带用于鉴别。5 结果判定红外光谱在药品分析中，主要用于定性鉴别和物相分析。定性鉴别时，主要着眼于供试品光谱与对照光谱全谱谱形的比较，即首先是谱带的有与无，然后是各谱带的相对强弱。若供试品的光谱图与对照光谱图一致，通常可判定两化合物为同一物质（只有少数例外，如有些光学异构体或大分子同系物等） 。若两光谱图不同，则可判定两化合物不同。但下此结论时，须考虑供试品是否存在多晶现象，纯度如何，以及其他外界因素的干扰。采用固体样品制备法
14、，如遇多晶现象而使实测光谱与标准光谱有差异时，一般可按照药品红外光谱集中所载重结晶处理法或与对照品平行处理后测定。但如对药用晶型有规定时，则不能自行重结晶。其它影响常可通过修改制样技术而解决。由于各种型号的仪器性能不同，试样制备时研磨程度的差异或吸水程度不同等原因，均会影响光谱的形状。因此，进行光谱比对时，应考虑各种因素可能造成的影响。6 常见的外界干扰因素6.1 大气吸收（1）二氧化碳 2350cm-1，667cm -1。（2）水气 39003300cm -1，18001500cm -1。（3）溶剂蒸汽6.2 干涉条纹 规律性的正弦形曲线叠加在光谱图上。6.3 仪器分辨率的不同和不同研磨条件的影响。
