1、荧光分光光度法,简介,1.和UV异同点2.荧光分析法主要应用范围与常用方法 3.优势,1.与UV异同点 1)构造与UV很相似. 属于分光光度法,光源.单色器等 2)组件的布置稍有不同 荧光采用激发光和发射光 成直角的直角光路., 3)原理也不一样.这在后面介绍,2.荧光分析法主要应用范围1）生物技术的分析,免疫技术的分析,如DNA、抗体、抗原等; 2）痕量元素的分析，如70多种无机元素； 3）间接测定众多的有机物，包括药物。,荧光分析一般分为三种：,1.X射线荧光分析（X射线） 2.原子荧光分析（激光） 3.分子荧光分析（汞弧灯）,3.优势 1）灵敏度高：比UV高23个数量级. 2）信息多:
2、激发分光光谱（信息同于UV）、发射光光谱的发光强度、发光寿命、量子效率、荧光偏振等多种信息,定性更好;,3）工作曲线的线性范围宽（定量更准） 应用范围也广微量元素的分析、医药、环境,石油工业等能直接或间接分析众多的有机物 4）专一性强：许多物质的测定采用间接法. 伯乐公司的Labeled DNA的荧光标记物 Labeling kits.,荧光发光的原理:,激发和发射过程 1.激发过程： 基态：能量最低状态 S0 激发态:电子处于反键轨道上为激发态 最有意义的为*和n*过程 电子激发过程很快，10-15 S， 不稳定。,2.发射过程 当激发态在返回基态时，伴有光子的辐射称为发光过程，又称发射过程
3、。荧光和磷光均为此种光致发光过程。(又称冷光)实际从激发态回到基态过程充满竞争。,(jablonskii)杰不朗斯基的图解,S: 基态 S*激发态 S0、基态 F :荧光 P:磷光 S1:为单一态的低能级 T: 三重态Three VR:振动驰豫Vibratory Relaxation 内转换 ： Inter Crossing 系内转换： Inter System Crossing,1）单一态 激发过程中,当S=0时为单一态. S原子光谱谱项符号量子数S 的2S+1表示谱项的多重性， 自旋量子数ms（电子） 可取值只有1/2（即顺旋或反旋） 自旋的两种状态: 当自旋配对时.S=0，不配对则S=1
4、,2）三重态. S=1则2S+1=3 A.跃迁时通常自旋不变，即单一态单一态； B.激发过程中自旋方向被倒转或改变了，则为三重态； C.三重态的能量比相应的单一态高，但能量差要低.应该到三重态. D.单一态向三重态的跃迁属于跃迁禁戒， 跃迁几率为单重态向单一态的10-6。,3）振动驰豫 Vibratory Relaxation 溶质分子向溶剂转移过剩的振动能吸收跃迁所需的时间很短(10-15S)，分子具有的几何形状及所处的环境还来不及改变 ，可能发生两种变化 直接从激发回到基态（发射光子）10-910-7S 发射辐射前改变振动能级. 10-1110-13S,溶质分子向溶剂转移过剩的振动能而发生
5、的分子驰豫是相当快的，在10-1110-13S就能无辐射而降落到受激态最低振动能级，因为快，所以溶液中分子快速振动驰豫后，光子发射总是由受激态的最低振动能级发生的。,4）荧光 Fluorescence分子处于受激态的最低振动能级后，变化之一发射光子回到基态-荧光 波长：荧光光谱吸收光谱 量子效率: 受激单一态的寿命在10-910-7 ，若无其他竞争，则全部受激分子发射荧光，=1； 实际有竞争，0-1之间,5）内转换: (IC)Inter Crossing A.全部激发能转变为热.而本身回到基态,即受激单一态与基态间转换，为低效率过程; B.受激单一态间(能量不同的单一态)的内转换则为多得多的几
6、率过程.(主要）,6）系内转换(ISC) ISC:单一态与三重态间的转换 对三重态布居粒子的高效途径是与回到基态发生争夺。 状态的改变是禁戒的，但发射光子回到基态需要10-9-10-7S,而内交换只需10-13S,比发射光子的时间更短.所以系内交换可与荧光发射进行竞争。,一般来说系内交换的几率愈大小取决于： 最低能量受激单一态与三重态的能量间隔愈小; 最低能量受激单一态的寿命愈长,(即发射光子愈慢) 几率愈大。,7）磷光 phosphorescence 受激三重态上的粒子回到单一态基态的形式是被禁戒的.但还是可发生的 原因：寿命很长(10-3S)及E小.总结:原理2步 激发ex, 发射em,发
7、时竞争,(jablonskii)杰不朗斯基的图解,三.量子效率:(在定量计算先讨论),影响发生的因素总的是内交换.(IC和ISC)。衡量发生的效率如何前已提到，以量子效率来判断；数值在01。其公式为 公式 = k：为速率常数,竞争由时间的快慢起重要作用,因此以其各影响因素的速率常数体现.,= Kf:荧光发生过程 Kx: 系内交联的ISC过程Kc:第一受激单一态的无辐射能量损失过程或讲将其激发能转变为热能过程的IC过程。 KfKc和Kx f-1， Kc或Kx Kf 则f-0 无荧光 Kf大小影响f的大小,3.影响k的因素: 1）Kf为最低受激单一态与基态之间跃迁几率大小的量度。 max(摩尔吸光
8、系数) 当max变小时.可预期Kf也相应变小； *吸收带的max大于n*,大约大10倍. *的Kf远比后者大,2）Kx ISC的几率的大小强烈依赖单一态和三重态之间的能量大小。能量差愈小，则ISC几率大，Kx变大 3）Kc受环境因素的影响最为强烈，主要影响是T。 随T变大碰撞变多，无辐射去激活的几率增大。Kc增大。 大量实验证实：大多数分子，随T升高。f会变小。,四荧光发光光谱仪的构造：,待测的化学物系盛在玻璃或石英容器中。和UV类似。样品由激光光源发生的紫外或可见光激发。光源通常是高压氙弧灯。或高压汞弧灯。再用单色器，选择合适的激发光波长区。荧光的发射是向所有方向的，现放在与激发光轴成直角放
9、置的发射光单色器只能收集到所发冷光的一小部分。由发射光单色器选出要进行测量的发光波电区。检测由光电倍增管，再将所得信号放大，并显示描绘出。,五荧光的定量分析：,公式：I f=fIa Ia:所吸收的光的强度; I0:入射光的强度 It:透射光的强度 UV中 T= It/ I0=10-bc It= I010-bc Ia= I0- It= I0（1- 10-bc） 若将指数项展开为级数。当吸光物质视为稀溶液即C0则可忽略幂次高于1的所有项，则上式为 I f =2.303fI0-bc,I f =2.303fI0-bc,同时在c浓度小时,I fC成线性关系.I f跟I0成正比I0增大可提高灵敏度。此定量
10、分析，除多了个量子效率，跟紫外定量一致，又对于同一种物质时,在同一条件，仪器.T.溶剂均一致则f应一致。,2实例： I fC经上公式推算，实质和紫外一致。在实际测量中。在找准em波长带.找到ex(max).即可以UV类似方法定量.如 不同在于弛豫后波长-红移,1.药物（西药类）,A.采用荧光分光光度法测定奥沙普嗪肠溶胶囊的含量，测定波长为Ex=287.0nm，Em=368.0nm。 B. SMZ ex=400nm , em=510nm C.替硝唑 ex=360nm ,em=420nm D.氟康矬 ex=261nm , em=284nm,2.药物（中药）,A.测定生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚，通过
11、选取适当的光谱校正点可扣除厚朴酚与和厚朴酚的光谱干扰和背景干扰,方法用于生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的测定 B.香内酯荧光分光法定量分析，其发射光谱em=(3851)nm，ex=301nm或激发光谱ex：(3281)nm，em：425nm,3.无机元素,A.测定杨梅黄素中痕量锗的新方法。锗与杨梅黄素在磷酸介质中形成配合物，此配合物在乙醇溶液中具有较强的荧光强度，Ex=446nm，Em=506nm。 B.海藻产品中的硒，采用荧光分光光度法测定海藻产品中的硒含量。 C.探讨耐药逆转剂对耐药细胞K562A02内游离钙离子(Ca2+i)浓度的影响 。,4.医学上,A.探讨谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)模拟
12、物环糊精(2-Se-CD)对中波紫外线损伤的防护作用。以小鼠成纤维细胞(NIH3T3)制备紫外线损伤模型，采用荧光分光光度法测定DNA裂解率，改良硫代巴比妥酸荧光法测定细胞脂质过氧化作用，流式细胞术测定H2O2。 B.采用最新合成的荧光试剂与大白鼠组织及食物中二羧基类化合物生成荧光诱导体，然后用以相荧光对大白鼠组织及食物中的乙二醛，甲基乙二醛 ，二乙酰和，二酰丙酮种二羧基类化合物同时进行分离定量检出，荧光检出波长为Ex=350nm，Em=390nm ，,5.药代动力学,A.建立测定大鼠血浆中环丙沙星的RP-HPLC荧光检测法和研究其体内的药物动力学。荧光检测，EX=276nm, EM=448n
13、m。 B.测定血液中左氧氟沙星的HPLC荧光检测法和研究其体内的药物动力学。荧光检测，EX=315nm, EM=440nm。,测血清中心律平含量.以往有用HPLC法测,此法,a.前处理麻烦.b.成批测量较好. 而改用荧光衍生化薄层色谱测时. 用丹磺酰肼对心律平中的羰基衍生化.则可克服以上缺点.在后面讲到最新的荧光测定可进行薄层色谱测定.,六:荧光光度计的发展,发展:1928年第一台光电荧光计问世以来.经过三阶段: 1.手动式. 2.自动扫描 3.微机化 随科技发展,激光,微机,电子学等新技术引进,推动了理论上的发展.,1. 分辨率提高：,48000S可测荧光寿命范围15s5ps,分辨率达2.5
14、ps. 48000SGH2型可测荧光寿命范围5.2s1ps,分辨率达0.5ps.,2.扫描速度加快,日立的F-4500型其中三维荧光测定为固有装置,扫描速度达30000nm/min三维荧光测量只需23 min.,3.多功能：,PE公司的LS-50B发光分析仪,可同机进行荧光、磷光和化学发光测量，利用光纤传感的平板扫描仪附件还可进行薄层色谱分离斑点的扫描测定；采用8.3W的脉冲氙灯，同机可测磷光；相应的软件能获得三维方式或文件轮廓显示的谱图.,4.促使应用技术的扩展,时间分辨(相分辨) 荧光偏振(荧光免疫) 同步荧光 三维荧光和 (美SLM亚明科公司.)荧光光纤化学传感器等分析新方法相继出现10
15、-6S级荧光寿命的测定。,荧光测量新技术及应用:,荧光偏振及各向异性:,1.在偏振光的激发下.荧光体所发射的荧光在空间不同取向的强度不同,亦是偏振光. 2.荧光偏振值P和各向异性r的公式 P=I1-I2/ I1+I2 r= I1-I2/ I1+2I2 式中I1和I2分别为检偏器的取向平行或垂直于起偏器取向时所观察到的荧光强度. 3.荧光偏振不仅与荧光体分子形状大小,荧光体吸光对偏振激光的取向、光选择性以及许多外界因素都有关，用处很大.比如环境的粘度等都会影响和改变其偏振度.从而在生化领域中获得广泛的应用.,应用,大小:可用于确定生物分子间的缔合反应量(缔合量大,则转速小,偏振度加大) 粘度:膜
16、内微粘度对偏振影响 对蛋白质的衰变和转动速度的研究,在荧光体的偏振度与荧光体的转动速度成反比.此用于荧光免疫分析. 如:当小分子荧光体联接到大分子蛋白质或抗体上以后.由于体积变大.分子转动速度变慢.偏振度增大;若样品中存在小分子的抗原,则就有可能抗原把联在抗体大分子上的荧光体夺走.结果偏振度又下降.从而可用于抗原或抗体的测定.,时间分辨荧光光谱,时间分辨荧光光谱技术是基于不同发光体发光衰减速度不同.寿命不同.在进行这种测量时要求带有时间延迟设备的脉冲光源和带有门控时间电路的检测器件,从而可在固定延迟时间td和门控时间tg,用发射单色器进行扫描.可得到时间分辨发射光谱。,作用:,A.可对发射光谱
17、重叠但寿命有差异的组分进行分辨和分别测定. B.固定发射波长对门控时间进行扫描,从而可得到荧光强度随时间的衰变曲线和给定时间处的荧光发射谱,可用于荧光寿命得测量和relaxafion时间的测量等. C.时间分辨荧光技术还能利用不同光体形成速率的不同进行选择性测定，排干扰。,如Th,Zr,Al络和物荧光时间分辨率图时间分辨荧光技术还能利用不同发光体形成速率的不同进行选择性测定.钍-桑色素-ToPo-SLS体系,利用时间分辨荧光法消除铝,皓等的干扰,测定水中痕量钍的荧光时间分辨图.从图可见,在12 S内测定荧光信号可消除铝,皓等的影响.近年国内药物分析杂志存在以桑色素-锗去测其含量,同步扫描.,根据激发光和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系 同步扫描技术分类:固定波长差固定能量差可变角三类 . 优点:使光谱简化谱带窄化,提高分辨率,减少光谱重叠提高选择性,减少散射光的影响等,应用,例如;酪安酸和色氨酸的荧光光激发谱很相似,发射光谱又严重重叠,但15nm时的同步光谱只显示酪氨酸的光谱特征, .60nm的同步光谱只呈现色氨酸的光谱特征.从而实现分别测定.,谢谢大家！,
