1、 槲皮素肺、心含量的测定1. 药动物学试验实验鼠（150g200g ，265？g 表达准确些）给药前禁食 12h，自由饮水。用 0.5%的羧甲基纤维素钠溶液分别将橙皮素和甘草次酸制成悬浮液，高浓度（溶液组成：槲皮素+0.5% 羧甲基纤维素钠）灌胃给药（橙皮素）20mg.kg -1，低浓度（溶液组成：槲皮素+0.5%羧甲基纤维素钠+甘草次酸）灌胃给药槲皮素)10mg.kg-1。空白对照组实验鼠灌胃 0.5%羧甲基纤维素钠。将实验鼠按三雄三雌随机分组，每组共 6 只。按要求给药，根据分布相、平衡相、消除相分别在给药后 1.5 小时、3 小时、4 小时、空白组为灌药后 1 小时宰杀实验鼠，迅速取出肺
2、、心组织，用生理盐水冲洗，置于冻存管中（放置分别是 1 雌、1 雄、2 雌、2 雄共 4 支离心管） ，于冰箱中冷冻保存。2.溶液的配制槲皮素储备液：精密称取橙皮素 25mg，置于 50ml 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得 500ug.ml-1 的橙皮素贮备液，使用时用甲醇稀释至所需浓度。橙皮素内标液：配制橙皮素浓度为 0.2mg.ml-1 溶液 50ml，即 0.2 mg.ml-1*50ml=10mg，槲皮素百分含量 97%，则将 M 槲皮素 =10mg/97%=0.0103g 溶解于甲醇中配制成浓度为 0.2mg.ml-1 的橙皮素内标液.3. 组织样品的处理从冰箱中取出肺、心组织样，解
3、冻，将组织先剪成几大片，剔除组织周围其他杂质成分如血块等，再剪碎，滤纸吸干。分别称取组织 0.2g，按 2.5ml.g-1 组织加入生理盐水（0.5ml） 、20ul 内标液（橙皮素浓度为 0.5mg.ml-1）制成组织匀浆液。在组织匀浆液中再加入甲醇600ul，涡旋 60s，3500（可以转数更高，建议最好 10000，以节约时间，和充分沉淀）转每分钟，离心 15min，定量吸取上清液 800ul（尽可能吸多，但所有过程要求取出体积一致） ，50 摄氏度氮气流下吹干（即已预处理过的组织干样）冰箱冷藏备用。测定时将上述干品用 HLPC 流动相（100ul，用甲醇）再次溶解，涡旋60s（或用移液
4、枪混合均匀） ，10000 转/分钟离心 3-5min，取上清液 20ul 进样。3. 测定方法、条件(1)色谱条件(该条件要试验，保证内标与待测物峰充分分离，峰形好)CTO-20A 色谱仪，流动相流动相：甲醇：磷酸（45:55） ；检测波长373nm；流速 1.0ml.min-1；柱温 35 摄氏度；进样量 20ul。（2）方法专属性（看色谱图有没有干扰测试情况）空白(灌服 0.5%羧甲基纤维素钠)实验鼠组织样液；空白(灌服 0.5%羧甲基纤维素钠)实验鼠组织样液+对照品（槲皮素浓度1ug.ml-1） ；灌服低浓度药液实验鼠组织样液；灌服高浓度药液实验鼠组织样液；（分别测定上述空白、对照、低
5、浓度、高浓度组实验鼠体内肺、心组织槲皮素含量。在后面再测定）(3)标准曲线取大鼠空白组织（质量与含药组织相同） ，分别加入橙皮素浓度为0.05，0.10，0.50，1.00，5.00，12.50，25.0ug.mL -1（此浓度适合样品测定）系列浓度工作溶液各 100ul，得到系列含药组织（ug 药/g 组织） ，然后加入等量内标，按照上述 3 第二（即） 、第三段（即）处理，进样，以槲皮素峰面积A/内标峰面积为纵坐标，浓度 C（ug 药/g 组织）为横坐标，进行线性回归，求线性回归方程。（4）精密度实验和准确度取大鼠空白组织（质量与含药组织相同） ，分别加入浓度为1.0，5.0，12.0ul
6、.mL -1 的槲皮素溶液 100ul 制成低、中、高 3 种浓度的含药组织（ug 药/g 组织，标称值） ，然后加入等量内标，每个浓度平行 5 份，按照上述3 第二（即） 、三段（即）处理，进样 20ul，于 1d 内测定 5 次。求低、中、高 3 个浓度组织样的日内 RSD 值。日间精密度的测定以同样的方法进行，每天测定 1 次（份） ，连续测定 5d（其中一份应用日内数值） ，求低、中、高 3 个浓度组织样液的日间 RSD 值。由测定的槲皮素峰面积 A/内标峰面积比，从标准曲线可以计算得到三个浓度测定值 C2，准确度表示为测定值/，标称值（一般 1005%为宜）（5）稳定性试验取大鼠空白
7、组织（质量与含药组织相同） ，分别加入浓度为1.0，5.0，12.0ul.mL -1 的橙皮素溶液 100ul 制成低、中、高 3 种浓度的含药组织，各三份，按照上述 3 第二匀浆后，在-20 摄氏度条件下存放 5d，每次测定时，将三份全部拿出解冻，解冻后，将其中一份按照上述 3 第二、三段处理提取；另两份放回冰柜在-20 摄氏度冷冻，全冻后，将剩下两份全部拿出解冻，解冻后，将其中一份按照上述 3 第二、三段处理提取；另一份放回冰柜在-20 摄氏度冷冻，全冻后，拿出解冻，解冻后，将该份按照上述 3 第二、三段处理提取；检验样品在上述实验条件下的稳定性（以 RSD 表示） 。（6）提取回收率试验
8、（与（4）精密度合用数据）9 根试管，分别加入浓度为 1.0，5.0，12.0ul.mL -1 的橙皮素溶液 100ul 得中、高 3 种浓度，每个浓度平行 3 份，50 摄氏度氮气流下吹干（即已预处理过的组织干样）冰箱冷藏备用。测定时将上述干品用 HLPC 流动相（100ul）再次溶解，涡旋 60s（或用移液枪混合均匀） ，10000 转/分钟离心 3-5min，取上清液 20ul 进样。由标准曲线计算浓度 C1。提取回收率= C2/ C1100%注意：1：保证整个过程的条件一致性，这是定量的基础。如，组织重量、内标量、匀浆时生理盐水量，提取甲醇量，第一次离心后吸出量，复溶甲醇量等2：其它条件如匀浆的充分与否，涡旋均匀条件，氮吹条件等，要一致。3：注意安全，用电、机械，关门等4：经过初步试验，如果甲醇 600ul 可以良好提取你测定的物质（提取回收率 70%以上） ，则可以先将样品提取，氮气流下吹干（即已预处理过的组织干样）冰箱冷藏备用，建立好方法再做；否则，优化选择提取溶剂或条件，在做下去。
