1、RT-PCR 实验有三步：抽提 RNA，RT，PCR。要求：1.做 RT 前必需测 RNA 浓度，逆转录体系对 RNA 量还是有一些要求，常用 500ng 或 1ug。2. RT 按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的 cDNA 存在，不是单改变 Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT 和 PCR 时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在 RT 时，引物设计有 3 种方法即 a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和 c：特异的下游引物。如果用 a 和 b 方法，是扩增的所有的
2、 cDNA（理论上） ，还要用此产物做 PCR 的模板继续扩增。如果用 c 方法，那么要去那里查它的序列呢？http:/www.ncbi.nlm.nih.gov问题：在做 RT-PCR 遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的 RNA 的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！解答：1.RT-PCR 有两种做法：条
3、件具备的话可用 kit 进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再 PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于 PCR 的进行，当然也可能是我买的 kit 不太好。 （promega） 。2.RT-PCR 应具备的条件高质量的 RNA（保留后可做 5，3RACE） ；引物的（最好产物短点） ；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA 的浓度或是 cDNA 的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将 RNA 的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样） ；体系的均一性等。3.RACE我做过 RACE（3RACE 是宝生物的 Kit；5R
4、ACE 是 Gibico） ，但现在再进行另一个同源基因的 3RACE时却怎么也 P 不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE 的方法） ，而另一个基因的 3UTR 却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的 3UTR 太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR 的常用内标 bactin 和 GAPDH 的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。有关内参：RT-PCR 内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些） ，最好分开两管，把除了引物之外的 mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。问：我曾经作过同一管的 PCR
5、，内有 actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍） 。请教 mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的 PCR 的各成分的浓度？答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template2.2 时，说明 RNA 已经水解成单核酸了。如果 RNA 的量够，可在 260nm（A260）用分光光度法测定 RNA 的得率，1
6、个单位等于 40ug/mlssRNA。纯RNA 的 A260/A280 的比值为 2.0。A260/A230 的比值还表明 RNA 的纯度，其值小于 2.0 表明裂解液中有亚硫氰胍和 belta-巰基乙醇残留，其值大于 2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀 RNA。2）RNA 的电泳图谱一般的，RNA 的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测 RNA 的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测 28S 和 18S 条带的完整性和他们的比值，或者是 mRNA smear 的完整性。一般的，如果 28S 和 18S 条带明亮、清晰、条带锐利
7、（指条带的边缘清晰） ，并且 28S 的亮度在 18S 条带的两倍以上，我们认为 RNA 的质量是好的（见下图） 。以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们 RNA 溶液中有没有残留的 RNA 酶。如果溶液中有非常微量的 RNA 酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在 37 度以上并且是长时间进行的。这样，如果 RNA 溶液中有非常微量的 RNA 酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。下面，我们介绍一个可以确认 RNA 溶液中有没有残留的 RNA 酶的方法。3）保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从
8、RNA 溶液中吸取两份 1000 ng 的 RNA 加入至 0.5 ml 的离心管中,并且用pH7.0 的 Tris 缓冲液补充到 10 ul 的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入 70的恒温水浴中,保温 1 h。另一份放置在-20冰箱中保存 1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法 2 中的条件） ，则说明 RNA 溶液中没有残留的 RNA 酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果 70保温的样本有明显的降解，则说明 RNA 溶液中有 RNA 酶污染。如果你的 RNA 样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范 RNA 酶的骚扰，那么你的实验应该是很难失败了！
