1、一、反转录酶的选择1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶 H 活性相对较弱。最适作用温度为37 。2 禽成髓细胞瘤病毒（AMV ）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。最适作用温度为 42。3 Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在 Mn2 存在下，允许高温反转录 RNA，以消除 RNA 模板的二级结构。4 MMLV 反转录酶的 RNase H-突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的 RNA 转换成 cDNA，这
2、一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 mRNA 模板合成较长 cDNA。二、合成 cDNA 引物的选择1 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。2 Oligo(dT)：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3端 Poly(A )尾，此引物与其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Po
3、ly(A )RNA 仅占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。3 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与 mRNA 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。三、操作步骤1. 总 RNA 的提取。2. cDNA 第一链的合成（ Reverse Transcription）：目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL
4、 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。（1 ）在 0.5ml 微量离心管中，加入总 RNA 1-5g，补充适量的 DEPC H2O 使总体积达 11l。在管中加 10M Oligo（dT）12-18 1l，轻轻混匀、离心。（2 ） 70加热 10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1min。然后加入下列试剂的混合物：10PCR buffer 2l25mM MgCl2 2l10mM dNTPmix 1l0.1M DTT 2l轻轻混匀，离心。42孵育 2-5min。（
5、3 ）加入 Superscript1l ，在 42水浴中孵育 50min。（4 ）于 70加热 15min 以终止反应。（5 ）将管插入冰中，加入 RNase H 1l ，37孵育 20min，降解残留的 RNA。-20保存备用。3 PCR：（1 ）取 0.5ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2l上游引物（10pM） 2l下游引物（10pM） 2ldNTP(2mM) 4l10PCR buffer 5lTaq 酶（2u/l） 1l（2 ） 加入适量的 ddH2O，使总体积达 50l。轻轻混匀，离心。（3 ） 设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28-32 个循环。为了
6、保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照。（4 ） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。（5 ） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。四、注意事项1 在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂。2 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3 内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、-Actin（-肌动蛋白）等。其目的在于避免 RNA 定量误差、加
7、样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。4 PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。5 防止 DNA 的污染：（1 ） 采用 DNA 酶处理 RNA 样品。（2 ） 在可能的情况下，将 PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和 mRNA 的共线性。RT-PCR 引物的选择随机引物：适用于长的或具有发卡结构的 RNA。适用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有 RNA 的反转录反应。主要用于单一模板的 RT-PCR 反
8、应。 Oligo dT ：适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA。（原核生物的 RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA 不具有PolyA 尾巴。）由于 Oligo dT 要结合到 PolyA 尾巴上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长 cDNA 合成量大大减少。 基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的 SuperScript One-Step System 特别适合于与基因特异性 引物连用。 RT-PCR 影响因素RT-PCR 反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数
9、等。 建议选择 0.5-3.0 mM (相差 0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。 对于具有较高 Tm 的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。 大多数目标 RNA 经 40 轮 PCR 反应就能观察到。但如果目标 RNA 太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到 45-50 次。随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA.适用于rRNA 、mRNA 、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。Oligo dT适用于具有PolyA尾巴的 RNA.（原核生物的RNA 、真核生物的 Oligo
10、dT rRNA和tRNA不具有PolyA 尾巴。）由于Oligo dT要结合到 PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA 合成量大大减少。基因特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性 引物连用。PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因 建议引物特异性差重新设计引物，改变引物的位置和长度，增强其特异性或使用巢式PCR引物引物浓度过高 适当减少引物浓度Mg2+浓度 Mg2+浓度过高适当降低Mg 2+浓度，从 1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。耐热聚合酶 酶量过多 以0.5U为间隔适当减少酶量退火温度 退火温度过低 适当提高退火温度或采用二阶段温度法PCR循环次数 PCR循环次数过多 减少PCR循环次数4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP 、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管
