1、RT-PCR 是将 RNA 的反转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（ PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA，再以 cDNA 为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中 RNA 病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列。作为模板的RNA 可以是总 RNA、mRNA 或体外转录的 RNA 产物。 。RT-PCR 用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建 cDNA 文库克隆 cDNA。RT-PCR 比其他包括 Northern 印迹、RNase 保护分析、原位
2、杂交及 S1 核酸酶分析在内的 RNA 分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR 可以一步法或两步法的形式进行。在两步法 RT-PCR 中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出 1/10 的反应产物进行 PCR。在一步法 RT-PCR 中，逆转录和 PCR 在同时为逆转录和 PCR 优化的条件下，在一只管中顺次进行。逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1 6 :
3、P1 * V2 A6 q1、 依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链2、 Rnase 水解活性：水解 RNA 杂合体中的 RNA； 3、 依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链cDNA.+ J I W/ H1 f“ $ X* i用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞 mRNA，三种都可。RT-PCR 实验有三步：抽提 RNA，RT，PCR。) b o# V试验前注意：# : N7 M, g8 M1. 做 RT 前必需测 RNA
4、浓度，逆转录体系对 RNA 量还是有一些要求，常用500ng 或 1ug! e# Z5 z, r- q+ S3 g) o0 z; 2. RT 按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR 如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的 cDNA 存在，不是单改变 Mg2+浓度、退火温度能解决的。引物合成- G4 l- g. x1 7 Z4 r# ( k S6 I1、 内参照：; 5 * i! L% u8 O: j% _2 |GAPDH0 F正义：5ACCACAGTCCATGCCATCAC3反义：5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3-actin# e n$ M- N N( + O% D2
5、P反义：5TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3) R: b! Y! n n( T7 n B* w% % C/ L$ z反义：5TGTATCTGCCTGGGACTG3、 退火温度计算（A+T）+4（G+C）0 r2 k6 w$ O6 / ( g1 正反义平均数，再上下波动度（4，或5）4、 引物各合成 5 OD，每 OD 一瓶分装好* k3 y; 1 4 g6 z3 C* c8 c“ q5、 引物稀释：加 DEPC 水量为（l ）= ? nmol / OD 管上所标 OD 数100 稀释为 10p mol / l 浓度的引物溶液注意事项： f Q$ T, v% |5 s- P& 1
6、 e1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴。2、Rt 时，先打开 PCR 预热 30 分钟。3、RNA 抽提前，打开离心机预冷。6 _9 R( x* T9 J0 V4、在所有 RNA 实验中，最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA 酶）的污染。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA 酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的 RNA 酶。RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。、做 RT 前必需测 RNA 浓度，逆转录体系对 RNA 量还是有一些要求，常用 500ng或 1ug。3 M6 + x- ( V7 R2 a“ i“ p0 s6、RT 按要求做，一般不会出太大问题。?4 N5 m- 4 d i$ i: k( D- Q7、PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的 cDNA存在，不是单改变 Mg2+浓度、退火温度能解决的。2 F/ A2 I! X8 l1 T J$ k8、注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：氯仿、溴化乙锭（EB）、酚、异硫氰酸胍、紫外线等
