1、RT- PCR相关知识及操作的总结RT-PCR(Realtime Polymerase Chain Reaction)即实时定量PCR。实时监测，由于 PCR扩增的指数时期，模板的 Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以称为定量的依据。与常规 PCR相比，RT-PCR 的优点：实时监测（在对数扩增时期）而不是终点检测；敏感度高；需要样品少；特异性高；精确定量。一、RT-PCR 的反应条件1.反应液（1）模板单、双链 DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白类。DNA模板一般 100ng /100L 。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（2）引物浓度0
2、.1-0.5 mol/L 。浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （引物设计：a 序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列；b 引物长度以 15-40 bp为宜；c 碱基尽可能随机分布,G+C 占 40-60%；d 引物内部避免形成二级结构；e 两引物间避免有互补序列；f 引物 3端为关键碱基；5端无严格限制。）（3）Taq DNA聚合酶0.5-2.5 U/50 l 。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTP（10mM or 2.5mM ）含四种核苷酸 dATP、dGTP、dCTP、dTTP ；dNTP 浓度取决于扩增片段的长度；浓度过高易产生错误碱基的掺入,
3、浓度过低则降低反应产量；dNTP 可与 Mg2+结合,使游离的 Mg2+浓度下降,影响 DNA聚合酶的活性。（5） Mg2+Mg2+是 DNA聚合酶的激活剂。浓度为 0.5-2.5mmol/L。Mg2+浓度过低会使 Taq酶活性丧失、PCR 产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中 dNTP、EDTA 等的浓度影响反应中游离的 Mg2+浓度。目前，市场上有各种试剂盒，可按其 protocol进行添加。2.循环参数（1）变性 使双链 DNA解链为单链； 94， 30-60 秒(2) 退火 温度由引物长度和 GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合
4、;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸70-75,一般为 72。延伸时间由扩增片段长度决定。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1Kb以内的DNA片段，延伸时间 1min是足够 的。34kb 的靶序列需34min；扩增 10Kb需延伸至 15min。（4）循环次数主要取决于模版 DNA的浓度；一般为 25-35次；次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加。（5）熔解曲线A 理解做“溶解曲线”的意义：PCR 产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR 产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。普通 PC
5、R的扩增产物通过电泳跑胶的方式来区分目的产物和非目的产物或者对扩增产物进行序列分析或者用Southern印迹杂交后者斑点杂交（引物二聚体、非特异性扩增产物）。荧光染料是 DNA双链小沟结合物，本身不具有选择性，能和所有的 DNA双链结合。在荧光 PCR染料法里，我们单单通过 PCR荧光扩增曲线来“判断”结果是不合适的。因为，非特异性扩增产物也能与染料结合，S 型的荧光扩增曲线中可能有局部 or全部的荧光来自非特异扩增的“贡献” 。鉴定并区分目的产物与非特异产物显然，需要通过溶解曲线。双链 DNA都有自己的 Tm值。可以通过 Tm值的不同，将不同的产物分开。在荧光 PCR中，大多扩增 100bp
6、左右的产物（最好不超过 200bp） ，退火和延伸时间较短。非特异的产物基本上都比目的扩增片段小。所以，在做溶解曲线分析时，目的片段的 Tm值较大，而非特异的 Tm值较小。B 降温速率普通荧光 PCR仪的降温速度默认是：1/cycle，能做 HRM的仪器，降温速度可设置为1/cycle。一般来说，不做 HRM，就设置 1/cycle 即可满足需要。C 温度区间理论上来说，能包含住产物 Tm值和非特异产物 Tm值即可。所以，一般设置在 50-95区间内均可。D 荧光采集时间若出于节省时间的考虑，用 5s都可以有比较不错的结果。二、RT-PCR 的方法选择1.SYBR Green I染料法2.Ta
7、qman探针法3.分子信标4.各种方法的应用比较三、荧光 RT-PCR技术的应用1. 绝对定量2.相对定量四、RT-PCR 反应性的确认五、Ct 值六、 引物二聚体1.引物二聚体的产生原因比较多，其中很重要的一个就是引物自身的原因，也就是设计的引物特异性不好，不能有效的和模板进行结合，而出现引物自身配对结合的情况导致二聚提的出现；其次还可能是 PCR体系及反应条件的问题，如果 PCR体系中引物、镁离子以及酶浓度过高等，都容易产生二聚体，这时要适当降低浓度，比如 20uLPCR体系中，一般 10pmol/ul的引物，加 0.2ul就可以了；还有可能是退火温度的问题，可以做个梯度 PCR或降落 P
8、CR，来摸索一个合适的退火温度，也可有效地减少二聚提的出现。2、杂带的出现在很大程度上来源于两个方面：一是引物的特异性问题，包括引物的长度和与模板的匹配度等。二就是退火温度的问题，一般适当提高退火温度可有效地减少非特异性扩增，从而减少杂带的出现。3.一般来说减少杂带的方法有：热启动 PCR(加热启动酶 或 先把 PCR仪预热） 、提高退火温度、做降落 PCR(每个循环降低 0.5度） 、降低底物浓度、降低镁离子浓度、减少循环次数等；其次，有些共溶剂（甲酰胺，DMSO）和添加剂（氯化四甲铵，谷氨酸钾，硫酸铵）能够降低高水平的错误引导与提高富含 G+C模板的扩增效率。另外还需要注意一些细节问题，如
9、 PCR反应体系的最好在冰上配制，Taq酶最后加，PCR 结束后产物勿放置在室温下过长时间等。4. RT中非特异性条带的产生和解决：a. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；b. 可能模板有问题（可能 cDNA有降解，这里我考虑你用的 2步法） ；c. 模板浓度过小，适当加大模板量；d. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些） ；e. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑 Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。七、关于 RT-PCR中逆转录步骤七、 试剂盒的具体操作步骤每个品牌都有自己的 protocol，按上面的进行操作即可。品牌中，takara 效果好，然而太贵，我用的 promegga，效果也可以。
