1、A549 细胞的培养A549 细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以 1：21：3 传代培养都是可行的。一、 所需溶液1， 细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)无 Ca、MgNACL 8.00g；KCL 0.20g;KH2PO4 0.20g;Na2HPO4 .。 12H2O 1.15g加水至 1 000mL,将 PH 调至 7.4，高压灭菌。2， 消化液（1） 胰酶-PBS结晶胰酶 2.5g;高压灭菌后的 PBS 1000ml用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过 0.22m 的滤膜过滤除菌，分装备用，放置20保存。（2） 胰酶EDTA:结晶
2、胰酶 0.5g;EDTA 盐溶液 0.2g无 Ca、Mg PBS 1 000ml用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过 0.22m 的滤膜过滤除菌，分装备用，放置20保存。3， 细胞培养液：RPMI 1640 培养液配制方法：（1） 将一袋干粉型 RPMI 1640 培养基溶于 900ml 三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。（2） 加入丙酮酸钠 0.1g，NaHCO 2 2g 以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100U/ML 青霉素和 100U/ML 链霉素。(一般市售的青霉素为 80 万 U/瓶，将其溶解于 4ml 三蒸水中，每升培养液中加入 0.
3、5ml；市售的链霉素为 100 万 U/瓶，将其溶解于 5ml 三蒸水中，每升培养液中加入 0.5ml)。（3） 调整培养液的值，用精密试纸观察 .即可。（4） 过滤法除菌，所使用的滤器为 加压过滤，.滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。（5） 分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置20保存。二、 细胞的维持和培养， 细胞的复苏（） 准备一个盛有温水的烧杯，从液氮罐中取出存有细胞的冻存管，放于温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。（） 1000000 r，3min 离心。（） 在无菌操作台中采用 75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。（） 用 1ml 枪头将上清液去除
4、，加入 1ml 预热的细胞培养液将细胞吹散开，转移至 25cm2培养瓶中。（） 补充 4ml 的 RPMI 1640 培养基，并且添加 10%的胎牛血清。（） 倒置显微镜下观察，37、5%CO 2培养。（） 24h 后，更换新的培养液。（） 常规传代培养。， A549 细胞更换新的培养液（） 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。（） 用 PBS 反复冲洗细胞 23 遍。（） 加入新鲜的预热好的培养液及 10%的胎牛血清。各种液体需要量（ml）表面积 25cm 2 75cm2 150cm2洗涤 3 5 10胰酶 12 13 25培养液 5 10 20（） 倒置显微镜下观察，37、5%CO 2培养
5、。， A549 细胞的传代（） 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。（） 向已经长满的细胞中加入消化液 1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面 2遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。（） 加入 1ml 消化液，在 37培养箱中孵育 5min 后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。 （） 加入 5ml 预热至 37的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。（） 吸取一半的细胞悬液，接种到新的 25cm2培养瓶中，补足培养液，并且添加
6、10%20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为510ml。（） 倒置显微镜下观察，37、5%CO 2培养。注意事项：（） 所有液体在加入细胞瓶前均应预热到 37。所有液体均应调整 PH 至 7.2 左右，均不能超过 7.4。（） 细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多，否则会损伤细胞。（） 严格执行无菌操作的要求。（） 尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可多添加些含牛血清的培养液中和。（） 培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。， A549 细胞的冻存（） 消化已生长融合的单层细胞。（） 用生长液悬浮细胞，并且添加 10%的 FCS 和 10%DMSO(二甲基亚砜)。分装在 2ml 容积的冻存管中。（） 用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管，放在-70冰箱中过夜。（） 放入液氮中冻存。
