1、1细胞培养1.1 培养基的配置： 将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水（水温 2030）到 950 毫升，轻微搅拌溶解。 加入 2.438 克碳酸氢钠。 轻微搅拌溶解，加注射用水至 1 升。 用 1mol / L 氢氧化钠溶液或 1mol / L 盐酸溶液调 pH 至 6.8-6.9。 用 0.2m 滤膜正压过滤除菌。 溶液应在 28 下避光保存。 1.2 胎牛血清的处理：没有灭活的血清中含有补体成分，需要将血清在 60条件下灭活 30 min。在水浴锅内进行，灭活的过程中，要不停的摇晃，是受热均匀，防止沉淀析出来。灭活后的胎牛血清最好分装后放
2、置-20，分装的目的是为了防止血清的反复冻融。1.3 CHO 的复苏1.3.1 预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入 37水浴锅内预热。1.3.2 取保存的安倍瓶迅速加入 37 度水浴锅中，不断摇动，保证 1min 内解冻。1.3.3 在超净台中加入 37 度预热的 DNEN 8mL 至离心管中，同时加入细胞冷冻液，800rpm 离心 5min。13.4 弃上清加入 37 度预热的 DMEM 和 10%的太牛血清 37 度 5%二氧化碳培养箱中过夜。1.4 CHO 细胞换液（复苏后的细胞，一般是在 4 小时或是 18 小时左右对培养基进行换液）1.4.1 预热
3、培养用液：把已经配好的装有培养液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入 37水浴锅内预热。1.4.2 取出细胞培养板，用移液器吸出平板内的培养基，用 PBS 或是培养基清洗细胞，注意清洗时把清洗液缓缓延平板边缘流进，防止用力过大吹起细胞。1.4.3 加入培养基 9ml，加 1ml 的胎牛血清。1.4.4 37 度 5%的二氧化碳培养箱中培养过夜。1.5 CHO 细胞细胞的传代培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄） ，而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。1) 悬浮细胞的传
4、代悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。 当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，800rpm 离心5 分钟，弃上清，加入约 2ml 培养液，吹打至均匀，滴加 2-3 滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖） 。2) 贴壁细胞的传代(1) 将消化液（胰酶）从冰箱中拿出，放在室温条件下预热；(2) 吸出全部培养液，沿壁缓缓加入消化液，将培养瓶有细胞面向下，加入消化液的量至刚好可以覆盖为止约 1ml，轻轻摇晃；(3) 置于 37 消化 2min 左右，其间在显微镜下观察，消化至细胞收缩变圆、部分脱
5、落即可停止消化（加入血清即可停止消化） ，以防消化过度；(4) 加入两到三吸管含血清的培养液，终止消化；用吸管轻轻吹洗培养瓶有细胞的一面，以使细胞脱落干净；(5) 细胞悬液转移至离心管内，800rpm 离心 5 分钟；弃上清，加入培养液，吹打至均匀，滴加 2-3 滴至已加入新鲜培养液（约 8ml）的培养皿中，置于二氧化碳培养箱中培养。传代的盘数根据细胞的数目确定，一般在 3-4 盘，传代后的数目约为 104。1.6 细胞计数在操作台上取一定量经离心过混合均匀的细胞溶液（约 0.5ml）放到小的灭过菌的板上，取出离开操作台后加入一定体积的 0.4%的台盼蓝染色，取染色好的细胞培养液慢慢加入到细胞
6、计数板上，要防止计数板上有空隙，然后在显微镜下数出细胞的数。 （一般取对角的四个大格或中间的方格然后去平均值*10 4） 。1.7. 细胞的冻存细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。1) 贴壁细胞经消化、离心收集，悬浮细胞经离心收集；2) 大约 106 个细胞加入 1ml 冻存液（细胞培养液和 10%DMSO） ，用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；3) 加入到冻存管中。如用 1.8ml 的冻存管，每管最好不要加入超过 1.5ml 的细胞悬液；4) 在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；5) 用厚布或卫生纸包裹冻存管，置于 4半小时，然后置于-20两小时，再置于-40两小时，然后置于液氮上方过夜；第二天将细胞置于液氮中；如果仅想提取细胞内的东西可以直接放在-20 度的冰箱中。6) 记下冻存管存放的位置，作好冻存记录。
