1、细胞培养基,细胞培养工程 南开大学药学院,2,培养基为细胞提供营养成分和关键生物活性物质，支持细胞生长、代谢以及生物学功能活性 主要营养成分 C 源：Glucose，Glutamine N 源：游离氨基酸，蛋白质水解物 脂类：必需与非必需脂肪酸，胆固醇 维生素：水溶性，非水溶性 矿物质（包括微量元素） 关键生物活性物质 细胞贴壁因子，促有丝分裂因子（参照血清成分） 在强化营养的同时，蛋白质水解物具有促有丝分裂作用 物理条件 pH，渗透压，溶解氧（Dissolved oxygen）,细胞培养基,3,细胞培养工业过程的两个阶段 细胞扩增（与化学过程催化剂角色相似） 产物形成（蛋白质表达）或细胞分化
2、（细胞治疗） 不同阶段分别优化细胞培养过程优化 充分了解细胞的生理需要和代谢特点 生长培养基与生产培养基分别优化 结合生物反应器操作，操纵细胞生长与代谢行为，使过程效益（或效率）最大化,细胞生长环境优化,细胞培养工程 南开大学药学院,在体内，细胞与血液不直接接触，物质交换依赖于庞大的毛细血管网络与细胞间质中的扩散过程,体内细胞间质的化学环境,Source: Cell Culture Bioprocess Eng. pp100,细胞培养工程 南开大学药学院,5,生物体液 血清 血浆 胚胎提出物 淋巴液 蛋白质水解物,天然培养基,细胞培养工程 南开大学药学院,6,现代培养基类型,细胞培养工程 南开
3、大学药学院,基底培养基（Basal Media） 糖 氨基酸 脂肪酸，脂类前体 维生素，核苷类 普通盐类，微量元素 pH 缓冲体系添加物（Supplements） 血清 生长因子/载体蛋白质 蛋白质水解物,（含）血清培养基无血清培养基 （Serum-free media）,7,培养基比较,细胞培养工程 南开大学药学院,复合（血清）培养基（Complex media） 血清含量可占到 20% 成分非完全确定 血清 植物蛋白质水解物 大豆磷脂,化学定义培养基（Chemically defined media） 所有成分明确 可能含有基因工程表达的蛋白质多肽 生长因子 细胞因子 载体蛋白,8,培养基
4、比较,细胞培养工程 南开大学药学院,无血清培养基（Serum-free media） 不含血清 成分完全确定 成分非完全确定 植物蛋白质水解物 大豆磷脂,无动物成分培养基（Animal component-free media) 所有成分明确 可能含有 生长因子 细胞因子 载体蛋白,为了避免动物病毒或朊蛋白污染，无血清培养基或无动物成分培养基已经成为工业标准，贯穿细胞库构建和生产过程。,9,培养基比较,细胞培养工程 南开大学药学院,无蛋白培养基（Protein-free media） 不含血清 不含任何蛋白质成分成分 可能含有 蛋白质水解物 非成分明确脂类或脂肪酸,细胞培养工程 南开大学药学院
5、,基底培养基（mg/L）,11,基底培养基成分分类,细胞培养工程 南开大学药学院,计量性消耗 大部分基底培养基成分，包括葡萄糖、氨基酸、维生素、核苷酸、脂类、脂肪酸、部分盐类、部分生长因子 消耗量与胞内能量产生、细胞生长和产物生成呈正相关计量关系 陪伴类 大宗盐类如 Na+、Cl-，白蛋白以及某些生长因子 胞内能量产生、细胞生长和产物生成所需量很小,细胞培养工程 南开大学药学院,12,pH 值范围 多数细胞系在 7.4 下生长良好 转化细胞系：7.0-7.4常用指示剂 - 酚红 pH 7.8 紫色 pH 7.6 红色略带蓝色 pH 7.4 红色 pH 7.0 橙色 pH 6.5 黄色,培养基的
6、物理性质 - pH,缓冲系统 细胞产生 CO2 和乳酸 NaHCO3 缓冲系统 生理 pH 区间缓冲能力差 毒性小 成本低 HEPES 缓冲系统 pH 7.2-7.6 缓冲能力较强 浓度：5 - 20 mM 成本高,细胞培养工程 南开大学药学院,13,渗透压 多数细胞耐受 260 - 320 mOsm/kg 人细胞浆的渗透压：290 mOsm/kg 更高的渗透压通常会使细胞生长速率减缓，但也常可使蛋白产物的合成速率加快 培养基营养物总浓度上限 测量方法 Freezing-point depression Elevation of vapor pressure,培养基的物理性质 渗透压,细胞培养
7、工程 南开大学药学院,14,温度 温度对细胞生长有直接作用； 避免温度过高； 在离开细胞培养环境之后，最好将培养直接置放在碎冰上； 过程开发：在细胞密度达到适合程度时，降低培养温度（如 30oC），阻止细胞生长但不阻止蛋白质合成。,培养基的物理性质 温度,Q: 培养基使用前需要预热吗？,细胞培养工程 南开大学药学院,15,表面张力和泡沫 贴壁培养： 培养基表面张力可促进贴壁细胞在介质上贴附 悬浮培养： 气泡形成是为细胞生长提供溶氧的主要机制 泡沫会使蛋白质变性的速率增加。加入硅油消泡剂降低表面张力，有助于防止泡沫生成 泡沫达到培养容器的顶部会增加污染的危险 泡沫在液面上的破碎过程是能量快速释放
8、的过程，会造成细胞的严重伤害。 Pluronic F68,培养基的物理性质 表面张力,细胞培养工程 南开大学药学院,16,细胞培养基的基本组成（1）,水 培养基 缓冲液 主要污染物 无机物：包括重金属、铁、钙、氯等。 有机物：主要是植物腐败的副产物和洗涤剂。 细菌：热原。 颗粒：主要是气溶胶物质。 注射用水（Water for injection, WFI） 水纯化单元操作：过滤、活性炭吸附、超滤、蒸馏、离子交换、反渗透、紫外氧化。 大规模生产：316L 不锈钢；高温循环,能源和碳源物质 六碳糖及糖酵解的产物 葡萄糖：5 - 20 mM 半乳糖： 果 糖：Glut-5，少数细胞种类 丙酮酸：
9、主要代谢产物：ATP，乳酸，CO2， TCA循环 谷氨酰胺：2 - 6 mM 消耗量相当于葡萄糖的10-20% 蛋白质合成 为核苷合成提供氨基 经 -酮戊二酸进入TCA循环 脱氨反应 水溶液自分解 血清具有谷氨酰胺酶活性,细胞培养基的基本组成（2）,Glut-1，大多数细胞种类,细胞培养工程 南开大学药学院,18,细胞培养基的基本组成（3）,氨基酸：蛋白质合成、含氮化合物的前体，能源。 必需氨基酸： 细胞无法自我合成； 谷氨酰胺：细胞能量代谢、蛋白质合成； 若干其它氨基酸：可能 12 种，必须从培养基中摄取。 非必需氨基酸：其余 7 种氨基酸可在细胞内自己合成，或通过转氨作用由其他物质转化而来
10、； 对谷氨酰胺的利用量通常超过其它必需氨基酸的总和； 丙氨酸常是被大量生成的氨基酸（谷氨酰胺代谢）； 各种细胞对氨基酸的种类和浓度有不同的要求，对氨基酸的利用也有差别，但除了谷氨酰胺外，通常亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸的利用量较大； 脯氨酸为重组 CHO 细胞所特需，天冬酰胺为某些肿瘤细胞系所必需； 甘氨酸有时在叶酸缺乏或甲氨蝶呤和氨基蝶呤存在下需要，丝氨酸常在克隆密度下所必需； 具体氨基酸利用情况需要通过氨基酸分析（HPLC）结果决定，不要被必需/非必需氨基酸生化定义所误导。,细胞培养工程 南开大学药学院,19,细胞培养基的基本组成（4）,维生素 维持细胞
11、正常生理状态的重要生物活性化合物，在细胞中多以酶的辅基或辅酶形式存在，对细胞的代谢过程有重要影响。 水溶性维生素： 生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醛（醇）、泛酸、核黄素、硫胺素、维生素B12、维生素C、对氨基苯甲酸等。 脂溶性维生素： 维生素A、维生素D、维生素E、维生素K等 溶解方法：先高浓度溶于有机溶剂如酒精 维生素的用量因细胞而异，但通常培养基中的量已经能够满足大多数细胞系的需要。,细胞培养工程 南开大学药学院,20,细胞培养基的基本组成（5）,无机离子 大宗离子 常见：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO4-、SO42- Na+/K+：细胞膜电位 Na+/CI- ：维持渗透压平
12、衡 Mg2+：酶反应的辅因子 Mg2+/Ca2+ ：细胞贴附 HPO4-/HCO3-: 缓冲作用 微量元素 常见：铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜 其它：无蛋白长期培养往往需要钴、锆、锗、镍、锡、铬、铝、锂、溴、碘、硼、氟、硅、钛、铷、银、钡等。 试剂等级 化学品和添加剂中普遍存在污染物和杂质 药典级如 USP 分析纯,细胞培养工程 南开大学药学院,21,细胞培养基的基本组成（6）,脂类和磷脂前体 有血清细胞培养：脂类来自于血清 无血清/无蛋白培养：需要添加脂类如胆固醇、脂肪酸、磷脂。 胆 碱：卵磷脂合成前体 乙醇胺：脑磷脂合成前体 肌 醇：肌醇磷脂合成前体 核酸前体 核酸 (RNA/DNA) 前体
13、通常不是培养基的必需成分 缺陷型 CHO 细胞：叶酸不足，添加嘌呤类（腺嘌呤和次黄嘌呤）和胸腺嘧啶有益于细胞生长。,细胞培养工程 南开大学药学院,22,细胞培养基的基本组成（7）,非营养性物质调节细胞的物理化学环境，间接影响细胞行为；抗生素：对细胞生长有不利影响，尽量避免； pH 缓冲剂：碳酸氢钠：常用 26 mM，与 5-10% CO2 平衡；HEPES：10-50 mM，更高会产生细胞毒性。 pH 指示剂：酚红商业化生产不予采用,血 清,主要类型 胎牛血清（Fetal bovine serum） 小牛血清（Calf serum） 马血清（Horse serum） 人血清（Human ser
14、um） 主要作用 促进细胞贴壁，多数原代细胞及许多细胞株具有贴壁生长要求； 刺激细胞生长与细胞分裂； 细胞营养来源； 对细胞的保护作用。,细胞培养工程 南开大学,23,血清成份（1）,蛋白质 白蛋白（Albumin）：转运（如脂类）、缓冲与保护功能 纤维连接蛋白（Fibronectin）：细胞贴壁 胎球蛋白（Futuin）：细胞贴壁（不是甲胎蛋白） 巨球蛋白（2-Macroglobulin）：抑制胰蛋白酶 Transferrin（转铁蛋白）：与铁结合，使其失去毒性并转运 抗体与补体（Antibodies & complements）： 多肽类 血小板衍生生长因子（Platelet-derive
15、d growth factor，PDGF） 胰岛素类生长因子（Insulin-like growth factor，IGFI/II） 成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF） 上皮细胞生长因子（Epidermal growth factor，EGF）,细胞培养工程 南开大学药学院,24,激素 胰岛素（Insulin）：葡萄糖吸收，刺激有丝分裂； 氢化可的松（Hydrocortisone）：贴壁，生长，分化； 代谢产物与营养物 氨基酸 葡萄糖 酮酸 许多其他营养物和中间代谢物 矿物质类 血清蛋白：微量元素和铁、铜和锌 硒：与还原型谷胱甘肽一起发挥抗氧化作用，
16、保护细胞 抑制剂 细菌毒素,细胞培养工程 南开大学药学院,25,血清成份（2）,取血（Blood collection） 减少供体动物痛苦； 无菌操作； 自然凝血（Natural clotting, 4oC） 血小板细胞释放关键生长因子，如 PDGF； 离心去除较大固体物质； 过滤：去除颗粒性物质，最终达到无菌 微生物污染，包括支原体和噬菌体； 膜过滤：1.2、0.8、0.65、0.45、0.22、0.1 微米； 0.1 微米多次。,血清的制备方法,细胞培养工程 南开大学药学院,26,特殊血清,透析血清（Dialyzed serum） 采用膜透析（生理盐水），去除干扰小分子化合物 活性炭/葡聚
17、糖处理胎牛血清（Charcoal/dextran treated FBS） 降低类固醇激素含量如黄体酮 降低血清批次间差异 热灭活血清（Heat inactivated serum） 血清中补体成分造成干扰 30 minutes of treatment at 56C（水浴） - 射线辐射 降低血清中潜在病毒浓度 106 倍,27,Source：http:/ 南开大学药学院,筛选 品种和批次之间存在生物活性差异； 购买前，应针对支持细胞生长的能力进行筛选； 筛选后，备足够数量以供长期使用。 冷冻储藏 保持血清成分的生物活性； 分装冻存 解冻：2 - 8 oC，期间轻轻混匀以减少蛋白质沉淀； 解
18、冻后，无菌操作，分装 50 毫升无菌离心管； - 80oC 冻存。 注意事项,血清的储藏,细胞培养工程 南开大学药学院,28,血清质量证明,Certificates of Analysis: Filtration statement Country of origin Cell growth performance testing Microbial sterility testing Screening: mycoplasma virus endotoxin haemoglobin IgG total protein,29,细胞培养工程 南开大学药学院,血清的主要问题,血清原料来源有限 血清
19、批次之间生物活性差异较大 血清是蛋白质药物生产的主要原料成本之一 蛋白质药物纯化成本 一般占蛋白质生产的总成本的 50% 以上 血清会引入大量杂质蛋白质（如 IgG），大幅度增加纯化难度和成本 BSA：过敏反应，药典安全水平 50 ng / 剂量 潜在生物污染 病毒 朊蛋白（疯牛病）,细胞培养工程 南开大学药学院,30,血清对细胞的负面作用 抗体交叉反应 干扰,胰岛素 vs 胰岛素样生长因子-1（IGF-1） 胰岛素对许多细胞类型有调控葡萄糖吸收的作用； 在较高浓度时，通过与 IGF-1 共享信号传导通路，胰岛素也具有促有丝分裂作用； IGF-1 可以刺激 DNA、蛋白质、糖原合成以及细胞周期
20、蛋白 D； 浓度 胰岛素： 1 - 10 g/ml （血液正常浓度 1.3） IGF-1： 100 - 200 ng/ml 尽管不涉及内吞，胰岛素本身仍有稳定性问题，半衰期很短，IGF-1 则相对比较稳定 基因重组胰岛素和 IGF-1 上市,无血清培养基主要添加物,细胞培养工程 南开大学药学院,31,转铁蛋白（Transferin） 80 kDa 糖蛋白，N 和 C 端都有结合域与 Fe3+ 结合 转铁蛋白与受体结合之后被内吞并转移至溶酶体， Fe3+ 在酸性环境中被释放，转铁蛋白则迁移至胞外，循环利用； 胰岛素对许多细胞类型有调控葡萄糖吸收的作用； 转铁蛋白与异种受体结合能力比较弱； 基因重
21、组人转铁蛋白上市 可被其它蛋白质取代如血红蛋白 可被铁络合物取代（如柠檬酸铁），但需要较高浓度,无血清培养基主要添加物,细胞培养工程 南开大学药学院,32,toxic,血清白蛋白 血清中最丰富的蛋白质 难溶物的载体：游离脂肪酸 结合有害混合物：胆红素、重金属离子 0.1-5 mg/ml 基因工程人血清白蛋白上市,无血清培养基主要添加物,细胞培养工程 南开大学药学院,33,toxic,蛋白水解物 动物或植物组织水解物或提取物曾经用于细胞培养，以减少对血清的依赖； 动物来源水解物或提取物现已剔除，取而代之的是大豆、稻米、小麦的酶或酸水解物； 含有氨基酸、短肽、无机盐、碳水化合物和维生素； 功能： 以短肽形式提供氨基酸，以较小渗透压代价富化培养基 某些短肽可能起到细胞因子的模拟混合物，与受体结合，起到促进细胞生长、延缓细胞凋亡的作用,无血清培养基主要添加物,细胞培养工程 南开大学药学院,34,细胞培养工程 南开大学药学院,35,实验技术 1 培养基过滤,醋酸纤维素膜 结构非对称性 亲水性 干燥：空气通过 湿润：空气排斥 过滤前后完整性测试,细胞培养工程 南开大学药学院,36,实验技术 1 培养基过滤,滤器准备,细胞培养工程 南开大学药学院,37,实验技术 1 培养基过滤,培养基过滤,细胞培养工程 南开大学药学院,38,实验技术 1 培养基过滤,过滤后滤器完整性测试,http:/
