1、细胞培养基本技术概述,细胞培养所用玻璃及塑料 制品的清洗与消毒,清洗,在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗 塑料制品的清洗,玻璃器皿的清洗,包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤 清洗后的玻璃器皿 干净透明无油迹 不能残留任何物质,浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉 新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等 先用自来水简单刷洗，然后用5
2、稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质 再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉 用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上,刷洗： 用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质 刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度,浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中 清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质 浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时 清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml） 强清洁液 631000200000 次强清洗液 1202001000 弱清洁液 10010
3、0100 配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色,冲洗 在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹 最好用洗涤装置 如用手工操作 需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用,胶塞的清洗,新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理 常规清洗方法 每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），
4、自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用,塑料制品的清洗,塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品 必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用,消毒,细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染 常见原因： 操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底 由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染,消毒灭菌方法,物理消毒灭菌法 紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30
5、min 湿热（高压蒸气灭菌法）：121，20min 干烤：160, 2 小时 过滤：0.22m 化学消毒灭菌法 70%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理 1新洁尔灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒 抗生素 主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染,细胞培养常用物品,细胞培养基,市场上可提供干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便 常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖
6、（标准型）、McCoys 5A、M199、F10等,细胞培养基应用选择,选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考： (1 ）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 (3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640 。 (4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。,血清,热灭活：56, 30 分钟加热已完全解冻的血清 热灭活目的
7、：灭活血清中的补体成分。除非必须，一般不建议作热灭活处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。补体参与反应有：细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化 血清中的沉淀物 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使
8、用，更换另一批号的血清,平衡盐液体,组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分 用于洗涤组织、细胞等,PBS（Phosphate-Buffered Sallines） KCl 0.20g KH2PO4 0.20g NaCl 8.00g Na2HPO47H2O 2.16g DPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）标准型 CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙) 0.10g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl26H2O 0.10g NaCl 8.00g Na2HPO47H2O 2.
9、16g,Hanks 平衡盐溶液（Hanks Balanced Salt Solutions，HBSS） CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙) 0.14g KCl 0.40g KH2PO4 0.06g MgCl26H2O 0.10g MgSO47H2O 0.10g NaCl 8.00g Na2CO3 0.35g Na2HPO4 0.048g D-Glucose 1.00g Phenol Red 0.01g,D-Hanks 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS) KCl 0.40g KH2PO4 0.06g NaCl 8.00g NaCO3
10、 0.35g Na2HPO4 0.048g D-Glucose 1.00g Phenol Red 0.01g,消化液,分离组织和分散细胞 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液 单独或混合使用,胰蛋白酶溶液,主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散 消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用,称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%） 胰蛋白
11、酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右 保存条件：配制好的胰蛋白酶溶液必须保存在-20冰箱中，以免分解失效,胰蛋白酶溶液配制,EDTA4Na 溶液,一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02%。通常与0.25%的胰蛋白酶溶液按1：1 混合使用（混合液） 注意：使用EDTA 处理细胞后，要用Hanks 液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长 EDTA 溶液配制：用D-Hanks 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4冰箱保存,pH 调整液,NaHCO3 溶液 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌
12、或高压灭菌，分装，4保存 HEPES（分子量238.31）溶液 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES 使用终浓度一般为10-50mM 常配成1M 储存液：用200ml 双蒸水溶解47.6克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4保存,谷氨酰胺补充液,谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解
13、约50%，所以都是在使用前添加 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内 使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L（29.22g/L），配制时应加温30，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于20。使用时，在每100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mmol/L,酚红,大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH 在一些特殊培养液中不含酚红 因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样
14、作用,抗生素溶液,抗生素使用种类与浓度：工作浓度 储存温度 杀灭细菌 penicillin 100 u/ml -20 G(+) streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) 、G(-) gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) 、G(-)、支原体 amphotericin B 2.5 ug/ml -20 真菌 nystatin 50 ug/ml -20 真菌,器材和液体的准备,细胞培养用的玻璃器材 培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，160，2小时干烤灭菌后备用 手术器材、瓶塞、配制好的PBS液 15磅，121，20分钟蒸气灭菌 MEM培养液、小牛
15、血清、消化液 用G6滤器负压抽滤后备用,无菌操作中的注意事项,在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁 操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟 操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打 开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用 在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行,哺乳动物细胞冷冻保存,冷冻保存要点 冷冻过程要缓慢。4 3060 分钟-20 30 分钟 -80 1618 小时（或过夜）液氮长期保存 冻存细胞必
16、须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。细胞浓度控制在：11075107/ml。 常用细胞冷冻保存液 10DMSO 完全细胞生长培养液（20血清基础培养液） 10甘油 完全细胞生长培养液（20血清基础培养液）,冷冻保存细胞的解冻与复苏要点,快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟） 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中,
17、解冻冷冻保存细胞的离心方法,从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37水浴中快速解冻 将12ml 冻存细胞液加入到25ml 新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀 用80g 离心23 分钟，弃上清液 用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞 接种细胞到培养瓶中，起始密度为3105/ml。,细胞的原代和传代培养,原代细胞培养原理,细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、
18、幼仔的脏器等更容易进行原代培养,原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）,取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污 切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清 消化、接种培养：加入0.25胰蛋白酶一0.02EDTA混合消化液（510倍量），与组织块混
19、匀。置37水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入510ml完全生长培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养,原代细胞培养结果,细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长 如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层,传代细胞培养原理,体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养 细胞“一代”指从细胞接种到
20、分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增36次,传代细胞培养操作,将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置510分钟 在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入35ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液 将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养,传代细胞培养结果,一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，24天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代
21、,细胞培养常见问题解答,培养液pH 值变化太快,CO2 张力不对 按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5 到10 改用不依赖CO2 培养液 培养瓶盖拧得太紧 松开瓶盖1/4 圈 NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足 加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度 培养液中盐浓度不正确 在CO2 培养环境中改用基于Earles 盐制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液 细菌、酵母或真菌污染 丢弃培养物或用抗生素除菌,培养液出现沉淀，但pH值不变,用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下
22、来 用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌 冰冻保存培养液 将培养液加热到37，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液,培养液出现沉淀，同时pH 发生变化,细菌或真菌污染 丢弃培养物 抗生素除菌,培养细胞不贴壁,胰蛋白酶消化过度 缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度 支原体污染 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物 培养液中无贴壁因子,原代细胞培养物污染,原代培养组织在进入培养前已污染 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织,培养细胞生长减慢,由于更换不同培养液或血清 比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验 增加起始培养细胞浓度
23、 培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏 让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子 培养物中有少量细菌或真菌污染 用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。 试剂保存不当 血清需保存在-5 到-20。培养液需在28避光保存。含血清完全培养液在2-8保存，并在2 周内用完,何时须更换培养基？,视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可,培养基中是否须添加抗生素？,除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素,欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？,欲
24、回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡,细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？,冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜,冷冻管应如何解冻？,取出冷冻管后，须立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂,细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？,除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外，
25、绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题,培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？,一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度 当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞,Hanks 平衡盐溶液(HBS)要在空
26、气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hanks 平衡盐溶液(HBS)和Earles平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？,HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。,悬浮性细胞应如何继代处理？,一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细
27、胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。,支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？,不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。,支原体污染会对细胞培养有何影响？ 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？ 直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。,为何培养基保存于4 C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？,培养基保存于4 C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。,
