1、细胞培养 （普通混合培养）一、 常规必备：1. 溶液1) PDL: Sigma, Cat. No.: P-0899 避光用超纯水配制好后过滤，200ul 或 400ul/tube 分装, -20 度储存。 母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为 0.1mg/ml(或 PLL：Sigma, Cat. No.: P-9404)2) HBSS: 1LNaCl 8.4gKCl 0.224gHEPES 2.38g青霉素钠 50 万单位硫酸卡那霉素 50 万单位用 1M NaOH 将 PH 值调至 7.1-7.2 左右,再用超纯水将渗透压调至 29010，过滤，-4 度储存。3）Trypsin Soluti
2、on0.125% Trypsin (Gibco BRL (1:250), Cat. No.: 27250-042)0.02% EDTA先用尽可能少量 HBSS 溶解 EDTA（用 1M NaOH 调 PH 偏碱，EDTA 溶解） 。再加适量 HBSS，用 1M HCl 还原 PH，溶解 Trypsin，最后定容。过滤，0.8ml/tube 分装，-20 度储存。4）DMEM （Dulbeccos Modified Eagle Medium）GIBCOCat. No.: 12100-046 (Powder, 10 x 1L)11952-092 (Liquid, 500ml) 5）FBS Gibc
3、o, Cat. No.: 16000044, 500ml分装：4ml/tube, -20 度储存6）F12 (F-12 Nutrient Mixture)GibcoCat. No.: 21700-075 (Powder, 10 x 1L)11765-045 (Liquid, 500ml)7）Neurobasal Media （without L-glutamine ）Gibco, Cat. No.: 21103-049, 500ml 8）B27 Gibco, Cat. No.: 17504-0449）GlutamateGibco, Cat. No.: 25030-14910）Cytosine
4、Arabinoside (阿糖胞甘 )SIGMA, Cat. No.: C1768-100MG用 DMEM 溶液溶解，过滤，1ml/tube 分装，-20 度储存。 （母液：500uM; 工作液：5uM）2. 器械解剖镜 1 台大剪刀 1 把短角形系结镊 2 把眼科剪 2 把止血钳 3 把二、 准备工作（按时间顺序）1. 培养前一天：高压灭菌玻片、25ml/100ml 容量瓶、50ml 离心管、15ml 玻璃管、培养皿（直径大概 70mm） 、超纯水2. 培养前：准备溶液含血清培养液：80% DMEM/10 F12/10% FBS (使用前先在培养箱孵育 2 个小时左右)3. 培养前：处理玻片
5、用 PDL 工作液包被灭菌后的玻片，室温放置 2 个小时以上或-4 度包被过夜。然后用灭菌好的超纯水洗三次，铺在 35mm 一次性培养皿内，晾干后用基配（ DMEM）包被，培养箱孵育。待用。4把解剖镜和解剖器械（眼科剪 1 把，止血钳 1 把和短角形系结镊 2 把）放到工作台内，UV 照射 20min 左右三、 种细胞1. 取材1. 动物房领鼠：SD rat E17-182. 工作台内准备：取冰袋、解剖液 30ml 和 Trypsin Solution 1 管，用 75%酒精消毒，放台内；35mm 一次性培养皿 3 个放在冰袋上，盛上解剖液；把 Trypsin Solution 放进培养箱孵育
6、；取出一个灭菌好的培养皿（直径大概 70mm） ，用来装胚胎。3. 取胚胎：先用 75%酒精消毒器械（大剪刀 1 把，眼科剪 1 把，止血钳 2 把） ；用适量乙醚麻醉母鼠；“V”字形剪开腹部，取出胚胎，放在准备好的培养皿内；处死母鼠；清洗器械；收拾台面。4. 工作台内取胎鼠海马：取下胎鼠脑袋（约 6 个） ，放进装有解剖液的一次性养皿内；左手用系结镊夹住两眼睛处固定脑袋；右手用系结镊划开脑颅、露出两大脑半球，镊子与脑干垂直、在嗅球前下压、往脑干处后拉、取出大脑，置于另一装有解剖液的培养皿；左手固定脑干，右手取出两大脑半球，置于另一装有解剖液的培养皿；去膜；解剖镜下取海马。2. 消化1. 取出
7、孵育好的 Trypsin Solution,把海马放进该消化液内；在培养箱内（37 度）消化12-15min；收拾台面；从培养箱取出处理好的玻片，将基配吸干。2. 消化结束后，先用孵育好的含血清培养液终止酶反应，重复 3-4 次把酶溶液洗干净；将海马转移到灭菌好的 15ml 玻璃离心管内，加 10ml 左右培养液，用移液管或1ml 移液枪轻轻吹打至悬液中无组织块；静置 3-5min；去除部分上清液，将细胞悬液转移到原来装培养液的瓶子内稀释（注意：管底要剩余部分悬液，以防内含大块组织。 ）3. 培养混匀最后稀释好的细胞悬液，种到吸干基配后的玻片上；标记好后尽快放进培养箱；24 小时候换培养液。四、 换液先提前把不含血清的培养液（1% Glutamate/2% B27/97% Neurobasal Media）放进培养箱孵育; 然后加血清（终浓度为 10%） ，给昨天种好的细胞换液。
