1、细胞培养基本方法(一)准备和安装过滤器 (二)合成培养基的配制 (三)小牛血清的处理 (四)生长培养基的配制(五)冻存细胞的复苏 (六)传代 (七)冻存 (八)注意事项 (一)准备和安装过滤器 清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径 0.22m 的微孔滤膜，用布包装好，15 磅 20 min 进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。 (二)合成培养基的配制1、根据细胞目录中的说明，按下表选择合适品牌及货号的培养基干粉，用适量超纯水充分溶解。 培养基 品牌 货号 D-MEM/F-12
2、GIBCO 12400024Dulbeccos Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (high glucose)GIBCO 12800017F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder GIBCO 21700075Iscoves Modified Dulbeccos Medium (IMDM) powder GIBCO 12200036Leibovitzs L-15 Medium powder GIBCO 41300039McCOYs 5A SIGMA M4892Minimum Essential Medium (MEM) Alp
3、ha Medium powder (MEM)with ribonucleosides and deoxyribonucleosidesGIBCO 11900024Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEM)without ribonucleosides and deoxyribonucleosidesGIBCO 12000022Minimum Essential Medium (MEM) powder GIBCO 41500034NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHNSMODIFICATION (F12
4、K)SIGMA N3520RPMI Medium 1640 GIBCO 31800022EGF SIGMA E9644Sodium pyruvate SIGMA P2256-25GMEDIUM 199, WITH EARLES SALTS AND L-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTEDSIGMA M50172、 按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES 等，充分搅拌使之溶解。3、 调 pH 至 7.2 左右。4、 加水至最终体积。5、 在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入 250 mL 或 500 mL 玻璃瓶中
5、，用翻帽塞塞紧瓶口。6、 瓶口封好，4冰箱贮存。 (三)小牛血清的处理 市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。胎牛血清不必灭活。1、 将血清加热至 56并保持 30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。2、 处理后的血清贮存于 4。3、 小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量。 (四)生长培养基的配制 除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。 1. 培养基分装成小瓶(100200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 2. 按如下比例配制：
6、 基本培养基占 8090，小牛血清或胎牛血清占 1020。 按1体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为 100 UmL 和 100 mL，。 (五)冻存细胞的复苏 1. 应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至 37-37。5 度，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化。 2. 在无菌台内将完全培养基加入 50ml 的小培养瓶内，约 5ml 左右，然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞，置培养并内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养。 (六)传代: 1. 贴壁细胞: 对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱
7、（或 PBS 洗 13 次）。50ml 培养瓶加入消化液约 1-3ml，按此比例进行消化，(根据经验)，晃动使消化液铺均匀置 37 度培养箱约 2-5 分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入 2-3ml 完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。 2. 悬浮细胞: 一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心 1000rpm，5min 后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。 (七)冻存 将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收
8、集，以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约 106/ml。加入 10%的 DMSO。以每管 12ml 分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。 (八)注意事项 1. 玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌 15 分钟以上;2)干烤消毒 140 度 2 小时以上; 2. 无菌工作台先清洗后用 75%酒精擦拭干净，紫外线照射 40 分钟以上;各种培养板照射 3小时以上; 3. 培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按 10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基 5-10ml 置培养箱内培养 2-3 天，肉眼见无浑浊或沉淀等
9、异物。分装后置 4 度保存; 4. 消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20 度保存; 5. 培养箱应先用清水清洗后用 75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射 1 小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌)。至少每月一次。 6. 进入操作时应注意先清洗双手及手腕，然后用 75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，如果数量较多，培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔一定的距离，开瓶(盖)时应先用 75%酒精反复擦拭或用灯烧，打开后应用灯先烧口，然后烧盖。用完后同样操作。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。
