1、USP 微生物限度检查 中文61）微生物限度检测 （MICROBIAL LIMIT TESTS）此章提供方法来检测可能存在的好氧微生物其他制药过程中可能出现的微生物的数量，包括原材料和成品中的。如果经过验证确认可以得到相同或更好的检测结论，也允许采用自动化的检测方法。在样品检测过程中须进行无菌操作。若无特别说明，则“培养（incubate）”一词指在 3035的培养箱内培养 24 至 48 小时；“生长（growth）”一词用于专门的判定，说明“存在和可能存在活的微生物”。准备实验 (Preparatory Testing)本章涉及实验结果的有效性取决于：提供的被检测样品本身在实验条件下，被充
2、分证明不会抑制可能存在的微生物的生长。因此，在准备样品时，需要正规的实验操作和符合要求的实验条件，接种稀释样品到含有以下（微生物）培养物的培养基：金黄色（奥里斯）葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）,大肠埃希氏菌（Escherichia coli）, 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa), 和沙门氏菌（Salmonella）。方法如下： 将用肉汤培养基培养 24 小时后的（微生物）不小于 10-3 稀释的微生物培养物，加 1 ml（微生物）培养液到磷酸(盐)缓冲液(pH 7.2)，液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein
3、Digest Medium），或者液体乳糖培养基（Fluid Lactose Medium）。相应培养基培养失败则需要采取以下方法更改检测程序： （1） 增加稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变；或者 （2） 中和一定数量的干扰因子；或者 （3） 结合（1）、（2）得出适当条件， 使接种物得以生长。以下是一些物质的成分和浓度，该物质及浓度可用于加入培养基、阻止物质发挥抑菌作用： 大豆卵磷脂（soy lecithin, 0.5%）或者聚山梨醇酯 20（polysorbate 20, 4.0%）。然后重复前面的实验，用液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯 20（Fluid Casein Dig
4、est-Soy lecithin-Polysorbate 20 Medium）论证待测样品里的防腐剂或其他抑菌因子被中和。若产品中含有抑菌物质且产品是可溶性的，则采用“无菌实验（Sterility Tests ）”里的“薄膜过滤法 (Membrane Filtration Method)”进行(微生物限度)检测会更适宜（suitable）。在抑菌物质得以适当中和、稀释液体积大幅度增加后仍不能排除抑制因子，以及不适宜用“薄膜过滤法”的情况下，可能会因为产品本身的杀菌作用导致细菌无法生长。当产品不能检测出接种菌种的情况下，应用光谱法确定产品的抑菌/杀菌成分。缓冲液和培养基 (Buffer Solu
5、tion and Media)按照下列配方配制培养基，或者使用规范厂商生产的培养基干粉进行培养基配制，所使用的干粉培养基应该与在此列出的培养基成分比例相似。在按列出的配方进行培养基配制时，用水溶解固体物质，必要时可以加热以得到完全溶解的均匀溶液。在使用前用盐酸或氢氧化钠将培养基的 pH 值调节到要求范围，调节 pH 值应在252O 条件下进行。若培养基配方有琼脂，应使用湿度不超过 15%的琼脂。溶解水为纯化水（Purified Water）。PH 7.2 磷酸(盐)缓冲液 储备液称 34g 磷酸二氢钾于 1000mL 容量瓶，加水 500mL 溶解。用氢氧化钠 TS 调节 pH 至 7.20.
6、1（约 175mL），然后加水至容量瓶刻度，混匀。分装溶液后灭菌。冰箱保存。培养基 除另有指出，培养基应在高压灭菌器中加热灭菌。（见“灭菌”章节中的“蒸汽灭菌”）。保存时间（exposure time）取决于培养基的灭菌体积。1、 液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯 20 培养基 酪蛋白胰酶消化物-20g 大豆卵磷脂-5g 聚山梨醇酯 20-40mL 水-960mL 将胰腺酪蛋白消化物和大豆卵磷脂溶解于 960mL 水中，4850水浴加热约 30 分钟得均匀溶液。加 40mL 聚山梨醇酯 20，混匀，按需要分装。2、 大豆酪蛋白消化物琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物-15.0g 大豆粉木瓜蛋
7、白酶消化物-5.0g (Papaic Digest of Soybean Meal) 氯化钠-5.0g 琼脂-15.0g 水-1000mL 灭菌后 pH 值：7.30.23、 液体大豆酪蛋白消化物培养基 按照无菌试验里的方法进行配制。 Soybean Casein Digest Medium under Sterility Tests. 酪蛋白胰酶消化物-17.0g 大豆粉木瓜蛋白酶消化物-3.0g 氯化钠-5.0g 磷酸氢二钾-2.5g 葡萄糖（C6H12O6 H2O）-2.5g 纯化水-1000mL4、 甘露醇-盐琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物-5.0g 动物组织胃蛋白酶消化物-5.0g 牛
8、肉膏-1.0g D-甘露醇-10.0g 氯化钠-75.0g 琼脂-15.0g 酚红-0.025g 水-1000mL 混匀，搅拌加热，煮沸 1 分钟得均匀溶液。灭菌后 pH 值：7.40.25、 Baird-Parker 琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物-10.0g 牛肉膏-5.0g 酵母膏-1.0g 氯化锂-5.0g 琼脂-20.0g 氨基乙酸（糖胶）-12.0g 丙酮酸钠-10.0g 水-950mL 搅拌加热，煮沸 1 分钟。灭菌，冷却至 4550，然后加入 10mL 灭菌后的亚碲酸钾（1:100）和 50mL 乳状蛋黄。轻柔混匀，。6、 Vogel-Johnson 琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物
9、-10.0g 酵母膏-5.0g 甘露醇-10.0g 磷酸氢二钾-5.0g（Dibasic Potassium Phosphate） 氯化锂-5.0g 氨基乙酸（糖胶）-10.0g 琼脂-16.0g 酚红-25.0mg 水-1000mL 溶解后煮沸 1 分钟。灭菌，冷却至 4550，然后加 20mL 灭菌后的亚碲酸钾（1：100）。 灭菌后 pH 值：7.20.27、 溴棕三甲铵琼脂培养基 白明胶胰酶消化物-20.0g 氯化镁-1.4g 硫酸钾-10.0g 琼脂-13.6g 溴棕三甲铵-0.3g Cetyl Trimethylammonium Bromide (Cetrimide) 丙三醇-10
10、.0mL 水-1000mL将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸 1 分钟得均匀溶液。 灭菌后 pH 值：7.20.28、 假单胞菌琼脂培养基 检测荧光生二氢荧光素 酪蛋白胰酶消化物-10.0g 动物组织胃蛋白酶消化物-10.0g 无水磷酸氢二钾-1.5g 硫酸镁（MgSO47H2O）-1.5g 丙三醇-10.0mL 琼脂-15.0g 水-1000mL 将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸 1 分钟得均匀溶液。 灭菌后 pH 值：7.20.29、假单胞菌琼脂培养基 检测绿脓菌溶素 白明胶胰酶消化物-20.0g 无水氯化镁-1.4g 无水硫酸钾-10.0g 琼脂-1
11、5.0g 丙三醇-10.0mL 水-1000mL 将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸 1 分钟得均匀溶液。 灭菌后 pH 值：7.20.210、 液体乳糖培养基 牛肉膏-3.0g 白明胶胰酶消化物-5.0g 乳糖-5.0g 水-1000mL 灭菌后需尽快冷却。 灭菌后 pH 值：6.90.211、 液体亚硒酸-双硫丙氨酸（胱氨酸）培养基 酪蛋白胰酶消化物-5.0g 乳糖-4.0g 磷酸钠-10.0g 亚硒酸钠-4.0g L-胱氨酸-10.0mg 水-1000mL 终 pH：7.00.2 混匀后加热得均匀溶液。在流动蒸汽中加热 15 分钟，不可灭菌。12、 液体连四硫酸盐培养基
12、 （四硫磺酸钠亮绿 TTB） 酪蛋白胰酶消化物-2.5g 动物组织胃蛋白酶消化物-2.5g 牛胆盐 Bile Salts-1.0g 碳酸钙-10.0g 硫代硫酸钠-30.0g 水-1000mL 煮沸溶液使固体物质溶解。使用当天加入 5g 碘化钾和 6g 碘到 20mL 水中配制成的溶液，然后加 10mL 亮绿（1:1000），混匀。加入亮绿后的溶液不可加热。13、 亮绿琼脂培养基 酵母膏-3.0 g 动物组织胃蛋白酶消化物-5.0g 酪蛋白胰酶消化物-5.0g 乳糖-10.0g 氯化钠-5.0g 蔗糖-10.0g 酚红-80mg 琼脂-20.0g 亮绿-12.5g 水-1000Ml 煮沸溶液
13、1 分钟使固体物质溶解。使用前灭菌，用融化后的培养基倒平皿，冷却凝固后使用。灭菌后 pH 值：6.90.2。14、 戊醛糖-赖氨酸-脱氧胞啶 琼脂培养基 戊醛糖-3.5g L-赖氨酸-5.0g 乳糖-7.5g 蔗糖-7.5g 氯化纳-5.0g 酵母膏-3.0g 酚红-80mg 琼脂-13.5g 脱氧胞啶钠-2.5g（Sodium Desoxycholate） 硫代硫酸钠-6.8g 柠檬酸铁铵-800mg 水-1000mL 终 pH：7.40.2。 搅拌加热使固体溶解，加热需恰好到沸点，不可过度加热或灭菌。溶解后立即转移到 50水浴，在培养基凝固前倒平皿。15、 亚硫酸铋琼脂培养基 牛肉膏-5.
14、0g 酪蛋白胰酶消化物-5.0g 动物组织胃蛋白酶消化物-5.0g 葡萄糖-5.0g 磷酸钠-4.0g 硫酸亚铁-300mg 亚硫酸铋-8.0g 琼脂-20.0g 亮绿-25mg 水-1000mL 终 pH：7.60.2。搅拌加热使固体溶解，加热需恰好到沸点，不可过度加热或灭菌。溶解后立即转移到 50水浴，在培养基凝固前倒平皿。16、 三糖-铁-琼脂培养基(TSI) 酪蛋白胰酶消化物-10.0g 动物组织胰酶消化物-10.0g 乳糖-10.0g 蔗糖-10.0g 葡萄糖-1.0g 硫酸铵亚铁- 200mg（Ferrous Ammonium Sulfate） 氯化纳-5.0g 硫代硫酸钠-200
15、mg 琼脂-13.0g 酚红-25mg 水-1000mL 灭菌后 pH：7.30.2。17、 麦康凯（MacConkey）琼脂培养基 白明胶胰酶消化物-17.0g 酪蛋白胰酶消化物-1.5g 动物组织胃酶消化物-1.5g 乳糖-10.0g 牛胆盐混合物-1.5g 氯化钠-5.0g 琼脂-13.5g 中性红-30mg 结晶紫-1.0mg 水-1000mL 煮沸溶液 1 分钟使固体物质溶解。灭菌后 pH：7.10.2。18、 Levine 曙红亚甲基蓝琼脂培养基 白明胶胰酶消化物-10.0g 磷酸氢二钾-2.0g 琼脂-15.0g 乳糖-10.0g Eosin Y-400mg 亚甲基蓝-65g 水
16、-1000mL 加白明胶胰酶消化物、磷酸氢二钾和琼脂于水，加热溶解后冷却。使用前融化，按如下量比加入其他液态成分，混匀：每 100mL 琼脂溶液加入5mL 乳糖溶液（1：5）、2mL Eosin Y 溶液（1：50）、2mL 亚甲基蓝溶液（1：300）。配制后的溶液应澄清。灭菌后pH：7.10.2。19、 Sabouraud 葡萄糖琼脂培养基 葡萄糖-40g 同比配制的动物组织胃酶消化物和酪蛋白胰酶消化物-10g 琼脂-15g 水-1000mL 混合，煮沸得均匀溶液。 灭菌后 pH：5.60.2。20、 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 取 300g 剥皮的马铃薯，放入 500mL 蒸馏水中煮溶，过滤，
17、加蒸馏水至 1000Ml，然后加入以下物质： 琼脂-15g 葡萄糖-20g 加热溶解后灭菌。灭菌后 pH：5.60.2。使用前倒平皿。待培养基冷却到 45时加入酒石酸溶液（1：10）调节 pH3.50.1，调节 pH 后不得再加热。 取样 (Sampling)每个检测项目需要 10mL 或 10g 样品。操作步骤 (Procedure)准备检测样品，用与样品物理性质相适宜的方法进行样品处理，处理程序不得改变样品最初的微生物数量和种类。以获得可用于检测操作的溶液或悬液。对于在一定范围内可溶解但溶解不完全的固体样品，可减少样品量，并加以注明。然后可采用“好氧微生物总数检查法（Total Aerob
18、ic Microbial Count）”、“金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法（Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa）”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法（Test for Salmonella Species and Escherichia coli.）”进行检测。对于液体样品，溶液或者悬液，或者酒精含量少于 30%的水醇溶液，以及易溶且完全溶解于90mL pH 7.2 的磷酸（盐）缓冲液或已指明的其他溶媒的固体样品，可采用“好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）”、“金
19、黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法（Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa）”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法（Test for Salmonella Species and Escherichia coli.）”进行检测。对于不溶于水的流体，药膏，乳酪，以及蜡状物，可用最小量限的、已灭菌的乳化剂（如一种 ploysorbates），通过机械搅拌、必要时可以进行不超过 45加热的方法将其制备成悬液，然后将悬液按“好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）”、“金黄色葡萄球菌和铜绿
20、假单胞菌检查法（Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa）”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法（Test for Salmonella Species and Escherichia coli.）”进行检测。对于气雾状态的液体样品。（省略）好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）对于易溶、溶液透明可采用“平板法（Plate Method）”的样品采用平板法进行检测；否则可采用“多管法（Multiple-tube Method）”。无论采用何种方法，首先精确量取 10.0g 样品（
21、固体）或 10.0mL 样品（液体）。将样品加入到 pH 7.2 的磷酸（盐）缓冲液、液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯 20 中至 100mL。如果 1：10 的样品溶液过分粘稠无法吸取，可继续稀释至 1：50 或 1：100 等稀释度直到获得可吸取的溶液。按照“准备试验”要求消除抑菌因素后方可进行好氧微生物总数检测。准备好的接种溶液应在 1 小时内加入样品。平板法（Plate Method）必要时对样品溶液进行稀释，直到每 1mL 液体中含菌量在 30 到 300 个之间。吸取 1
22、mL 供试液到 1 个已灭菌平皿，共做两个平皿的平行样。迅速地在每个平皿里加入 1520mL 加热溶解后冷却到 45 左右的大豆酪蛋白消化物琼脂培养基，盖上皿盖，顺或逆时针旋转平皿使供试液和培养基混匀，然后静置到室温待平皿冷却凝固。，倒置平皿，培养 4872 小时。培养完成后观察平皿内微生物生长状况，进行菌落计数。取两个平皿的平均菌落数作为每 g 或每mL 样品的微生物含量。如果 1：10 的稀释度未检出微生物，则结果表达为“样品微生物含量少于 10 个/g or mL”。多管法(Mulptiple-tube Method)向 14 支大小相同的试验试管中加入 9mL 灭菌液体大豆酪蛋白消化物
23、培养基。将其中 12 支试管分为 4 组，每组 3 支。（头 3 组分别标记为“100”，“10”和“1”），另外 3 支试管的1 组作为对照（controls）。（剩余 2 支试管分别标记为“A”和“B”）。向标记“100”的一组 3 支试管和第四支试管（A）里，各加入 1mL 样品溶液或悬液，混匀。然后从试管（A）里取出 1mL 加入到剩下的试管（B）里，混匀。这两支试管（A、B）分别含有样品 100mg（或 100ul）和 10mg（或 10ul）。然后从试管（A）里取出 1mL 溶液分别加入到第二组标记“10”的 3 支试管里，从试管（B）里取出 1mL 溶液分别加入到第三组标记“1”
24、的 3 支试管里。丢弃试管 A 和 B 里未使用的溶液。盖上试管口，培养所有的试管。培养结束后观察试管内的生长情况： 3 支对照试管应保持澄清；含样品溶液的试管，根据表 1 的计数规则，对每克或每 mL 样品可能含有的微生物数量进行计数。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法 （Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa）向样品中加入液体大豆酪蛋白消化物培养基至 100mL，混匀后培养。然后检查培养基生长情况。如果有生长情况，用接种环挑取少许在 Vogel-Johnson （或 Baire-parker、或Mannitol-S
25、alt）琼脂培养基上划线接种，以及溴棕三甲铵琼脂培养基。各涂布一个平皿。盖上皿盖倒置培养。若培养后培养基上未发现具有表 2 和表 3 所列出的培养物特征的菌落生长，则可判断此样品不含有金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。表 1 多管法(Mulptiple-tube Method)的最可能细菌总数每组试管里观察到生长情况的试管数量 每克或每 mL 样品最可能含有的微生物数量 每支试管里含有样品量 mg（或 mL） 100（100 uL） 10（10uL） 1（1 uL） 3 3 3 1100 3 3 2 1100 3 3 1 500 3 3 0 200 3 2 3 290 3 2 2 210 3 2
26、1 150 3 2 0 90 3 1 3 160 3 1 2 120 3 1 1 70 3 1 0 40 3 0 3 95 3 0 2 60 3 0 1 40 3 0 0 23表 2 金黄色葡萄球菌在选择性琼脂培养基上的微生物学特征选择性培养基 菌落的微生物学特征 革兰氏染色 Vogel-Johnson 琼脂培养基 黄色圈围绕的黑色菌落 阳性球菌（群生） Mannitol-Salt 琼脂培养基 黄色圈围绕的黄色菌落 阳性球菌（群生） Baird-Parker 琼脂培养基 黑色，有光泽，周围有 25mm 透明圈 阳性球菌（群生）表 3 铜绿假单胞菌在选择性和诊断性琼脂培养基上的微生物学特征选择性
27、培养基 菌落的微生物学特征 紫外荧光反应 氧化酶试验 革兰氏染色 溴棕三甲铵琼脂培养基 通常为绿色 绿色 阳性 阴性杆菌 假单胞菌琼脂培养基 检测荧光生二氢荧光素 通常为五色或黄色 黄色 阳性 阴性杆菌 假单胞菌琼脂培养基 检测绿脓菌溶素 通常为绿色 蓝色 阳性 阴性杆菌凝固酵素检查（Coagulase Test）金黄色葡萄球菌用接种环从 Vogel-Johnson （或 Baire-parker、或 Mannitol-Salt）琼脂培养基表面挑取典型的可疑菌落，每个菌落分别接种到单独的试管，试管内含有 0.5mL 兔或马血浆，有或没有任何附加（设施），37水浴，每 3 小时或其他适宜的时间间
28、隔观察一次生长情况，直到24 小时。阳性和阴性对照同时进行培养。如果没有发现任何程度的凝结，判断样品符合金黄色葡萄球菌检查。氧化酶和色素检查（Oxidase and Pigment Tests）铜绿假单胞菌用接种环从溴棕三甲铵琼脂培养基表面挑取典型的可疑菌落接种到检测荧光生二氢荧光素假单胞菌琼脂培养基和检测绿脓菌溶素假单胞菌琼脂培养基表面，每个可疑菌落分别接种。若需要接种的菌落数太多，可对接种的平皿表面进行分区，每个区域接种一个可疑菌落。然后将培养皿于 35倒置培养不少于 3 天。用紫外光扫描菌落表面，观察是否有表 3 所列的特征。通过氧化酶检查法确认可疑的菌落是否是铜绿假单胞菌。在菌落培养物
29、上/或将菌落培养物转移到预先浸润了 N, N-dimethyl-p phenylenediamine dihydrochloride 的滤纸：如果没有出现粉色变为紫色，证明样品符合未检出铜绿假单胞菌的要求。必要时还可以使用其他适宜的途径和生化试验来检定铜绿假单胞菌。沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法 （Test for Salmonella Species and Escherichia coli.）将样品放入适宜的容器，加入液体乳糖培养基至 100mL，培养。然后检查培养基生长情况，若发现生长物，混合并轻柔振荡培养液，用吸管分别吸取 1mL，各加入到 10mL 液体亚硒酸-双硫丙氨酸（胱氨酸）培
30、养基和液体连四硫酸盐培养基中，混匀培养 1224 小时观察结果。（同时需保留液体乳糖培养基残余培养液。）沙门氏菌属检查（Test for Salmonella Species）用接种环从液体亚硒酸-双硫丙氨酸（胱氨酸）培养基和液体连四硫酸盐培养基中挑取培养物，分别划线接种到亮绿琼脂培养基、戊醛糖-赖氨酸-脱氧胞啶琼脂培养基和亚硫酸铋琼脂培养基表面。倒置培养，如果未发现表 4 所列出的特征菌落，判断样品符合未检出沙门氏菌属的要求。表 4 沙门氏菌属在选择性琼脂培养基上的微生物学特征 选择性培养基 菌落的微生物学特征 亮绿琼脂培养基 细小，透明、无色或粉色到白色不透明（常有粉色或红色环带） 戊醛糖
31、-赖氨酸-脱氧胞啶琼脂培养基 红色，有或无黑色中心 亚硫酸铋琼脂培养基 黑色或绿色如果有表 4 所描述的菌落且经革兰氏染色呈阴性杆菌，则需要对可疑菌落进行进一步的检测。用接种针穿刺接种培养物到三糖-铁-琼脂培养基试管斜面下，培养。如果没有试管出现碱性（红色）或酸性（黄色）端头（有或没有伴随氢化硫黑色物质），则判断样品符合未检出沙门氏菌属的要求。大肠埃希氏菌检查（Test for Escherichia coli）用接种环从液体乳糖培养基残余培养液挑取培养物接种到麦康凯（MacConkey）琼脂培养基上。倒置培养。观察结果，若未发现符合表 5 所列出的微生物学特征的菌落，则判断样品符合未检出大肠
32、埃希氏菌的要求。表 5 大肠埃希氏菌在麦康凯（MacConkey）琼脂培养基上的微生物学特征革兰氏染色 菌落的微生物学特征 阴性杆菌(球杆菌) 红色块状物；可能有汁类沉淀环（surrounding zone of precipitated bile）如果发现符合表 5 所描述的菌落，需要进行进一步试验。 将可疑菌落用接种环挑取接种到 Levine 曙红亚甲基蓝琼脂培养基平皿上，每个菌落接种一个平皿。若需要接种的菌落数太多，可对接种的平皿表面进行分区，每个区域接种一个可疑菌落。倒置培养。如未发现有典型的金属光泽反射并在脉冲光线下无蓝黑色现象，则判断该样品符合未检出大肠埃希氏菌的要求。大肠埃希氏菌
33、的存在情况还可以使用进一步适宜的途径和生化试验来证明。Total Combined Molds 和酵母菌总数检查 (Total Combined Molds and Yeasts Count)采用好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）下的平板法（Plate Method）进行检测。培养基需使用同样体积的 Sabouraud 葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基代替大豆酪蛋白消化物培养基，并且应在 2025培养 57 天。复测 (Retest)若按之前的任一方法取 10.0g 样品进行检测得到的结果有可疑，应另取 25.0g 样品进行复测。仍按“操作步骤（Procedure）”的方法进行操作，但应根据加大后的样品量进行相应放大。
