1、病理技术总论 一、前言 二、概念 三、发展简史 四、常用病理技术 五、分子病理技术 六、方法选择,一、前言 重要性：技术，手段（关键） 硕士培养目标： 培养科研思路和方法 掌握进行科学研究的方法 今后工作的基础,二、概念 病理技术：进行病理研究或临床诊断必不 可少的方法或手段 相关学科应用，交叉 其它技术方法： 蛋白和基因检测等分子生物学技术,三、发展简史 距今2000年前 大体解剖、宏观病理 18世纪中叶 organ pathology（病理形态的开端） 19世纪中叶 LM cellular pathology 至今仍广泛应用 20世纪后（尤其是半个多世纪以来） EM 亚细胞水平（超微结构）
2、,20世纪以来 免疫病理免疫组化：蛋白水平 分子病理 原位杂交（起源于60年代末，近30余年发展）：基因水平 原位PCR（1990） 原位末端标记（1992） 原子力显微镜（近10年）： 原子(纳米)水平,传统三水平： 整体大体解剖、宏观 组织HE染色，组织化学染色 细胞三水平 蛋白（基因表达产物）：免疫组化 mRNA（基因表达）：ISH, IS PCR DNA(基因）: ISH, IS PCR 原位末端标记（apoptosis),技术进步分子、原子 基因水平揭示疾病的本质 近30年，形态定量、图像分析技术发展 病理技术向方面发展： 1. 宏观器官（肉眼）组织细胞 （LM）亚细胞（EM） 分子
3、（免疫组化，ISH, IS PCR TUNEL）原子（AFM） 2. 定性定量（图像分析）,四、常用病理技术 1. 动物实验和解剖技术：基本技术 不同动物抓取、给药、辐射等模型制作 脏器解剖部位、正确取材 2. 切片制作：冰冻和石蜡切片制作技术 3. HE染色技术掌握 固定：彻底 分化：适度,4. 组织化学（特殊染色）技术 方法多，专著，不同目的，选用不同的方法 特殊细胞肥大细胞，神经元 结缔组织三联染色 显示胶原、网状、弹力纤维 糖原PAS 脂肪苏丹 DNAFeulgen 染色 核仁组成区嗜银蛋白Ag-NOR,5. 电镜技术 SEM TEM 固定固定剂： 常用2.53%戊二醛（PBS) 取材
4、及时，115 mm2,6. 免疫组化 ABC: Ab1Bio-Ab2ABCDAB PAP: Ab1Ab2PAP(mouse or rabbit)DAB SP(LSAB): Ab1Bio-Ab2SA-HRPDAB SA-APNBT or FR APAAP: Ab1Ab2APAAP(mouse)FR BA: Ab1Boi-Ab2BADAB 免疫荧光： Ab1荧光-Ab2（荧光显微镜直接观察）,. 图像分析技术 专门课程 定性-定量 8. 显微照相技术,五、分子病理技术 1. 原位杂交 2. 原位PCR 3. 原位末端标记 4. 组织芯片（蛋白, mRNA, DNA） 5. 原子力显微镜 6. 共聚
5、焦激光扫描显微镜 7. 流式细胞仪,六、方法选择 （一）原则 1. 方法为目的服务，不能为方法而方法； 2. 简单方法能解决的问题不用复杂的方法。,（二）硕士阶段哪些方法合适 1. 常用病理技术肯定的方法 HE, 组织化学，EM, 免疫组化及定量 2. 分子病理技术ISH or TUNEL or IS PCR 3. 其它技术方面： 生理生化功能检测: Morris 水迷宫，血气分析 细胞培养技术：分子机制研究 流式细胞术：细胞周期，凋亡与坏死率 分子生物学技术：蛋白和基因操作技术 共焦激光扫描显微镜：荧光染色 原子力显微镜：细胞膜、大分子结构,（三）如何选择 据不同目的而不同 1. HE无条件
6、选择 2. 组织化学：根据不同目的选择 纤维三联染色、二联染色 糖原、脂肪PAS, 苏丹 细胞神经元尼氏体染色,3. 免疫组化 （1）含内源性HRP丰富的组织细胞 造血免疫系统不能用HRP作酶标方法 ABC, PAP, SP, BA (no) APAAP, LSAB (yes) (2） 含丰富内源性AP的组织 如肠不能用 AP作酶标方法 APAAP, LSAB (no) ABC, PAP, SP, BA (yes),4. 原位杂交 （1）探针：DNA变性 RNA降解，污染 寡核苷酸敏感性低 （2）标记物： 同位素敏感，半衰期，污染 非同位素Biotin(便宜，敏感性差） DIG(贵，敏感） 荧光不稳定，不能长期保存,5. 原位PCR （1）直接法：非特异，简单 间接法：特异，繁琐 （2）一般PCR：外源基因或突变基因 RT-PCR: 内源基因表达,方法选择,6. 原位末端标记 标记方法的选择 荧光 生物素 地高辛,方法选择,方法选择,原子力显微镜：细胞膜结构 共聚焦激光扫描显微镜：荧光标记物细胞定位 流式细胞仪：荧光标记定量细胞周期细胞凋亡/坏死率抗原标志物鉴定细胞膜电位钙离子,
