1、生物工艺学实验实验指导（适用生物工程专业）屈慧鸽 冯志彬 程仕伟编写鲁东大学生命科学学院实验一 呼吸缺陷型酵母菌株的诱变选育一、实验目的1、理解呼吸缺陷性酵母的筛选原理；2、掌握呼吸缺陷性酵母的筛选步骤。二、实验原理部分酵母菌在一定的物理（如紫外线）或化学诱变剂作用下发生基因突变而丧失呼吸能力，呼吸缺陷性酵母菌株即为丧失呼吸能力的突变株，其对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，但 CO2放出高于对照株，酒精脱氢酶活力也较对照高出 1 倍左右，对提高酒精产率有好处。同时，呼吸缺陷型也是育种工作可利用的一个有效的遗传标记。三、实验材料1.菌株：酒精酵母2.培养基CM 培养基：葡萄糖 40g
2、MgSO 4 2g蛋白胨 10g 琼脂 18g酵母膏 5g 水 1000mlKH2PO4 5g不加琼脂即为液体 CM，分装 20ml 于 250ml 三角瓶中。TTC 上层培养基葡萄糖 5g TTC（红氮四唑） 0.5 g琼脂 10g 水 1000ml分装，121灭菌 15min。TTC 下层培养基葡萄糖 10g MgSO 4 7H2O 0.4g蛋白胨 2 g 琼脂 18 g酵母膏 5 g 水 1000 mlKH2PO4 1 g pH 5.55.7MM 甘 培养基酵母膏 6.7 g 甘油 20 ml水 980 ml pH 5.5琼脂粉 18 g 分装，121灭菌 10min。3、仪器设备紫外诱
3、变箱、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱四、操作步骤1、培养基配制：配制实验过程中所需全部培养基并准备诱变及筛选所需的移液管、试管、平板等物品，121灭菌 20min，其中 TTC 上层板培养基灭菌后备用，无需倒平板；2、菌种活化：取活化后的酵母菌 1 环，接入到三角瓶中液体 CM 培养基，200r/min、30振荡培养过夜；3、菌悬液制备：将培养好的酵母细胞 4000r/min 离心洗涤 3 次，调整细胞浓度为 106/ml 备用，实验过程无菌操作；4、诱变：取 15-20ml 菌悬液于灭菌空白平板内，磁力搅拌器转速为 30r/min，调整与紫外灯管距离为 20cm，开盖照射 45-75s，
4、盖上盖诱变结束；5、稀释涂布：将诱变后的菌悬液梯度稀释至 10-6，于 CM 平板涂布，避光培养24-36h，选择菌落个数合适的平板备用；6、点接：将 CM 培养基平板上长出的菌落点种 TTC 下层平板上，30培养 24-48h；7、鉴定：将 TTC 上层培养基溶化并冷却（不烫手）后，小心倾入 TTC 上层培养基上，使其刚好掩埋菌落。等凝固后，30培养 23h。此时，平板菌落颜色会区分成红色、粉红色和白色。呼吸缺陷型突变株为白色菌落。8、复检：用无菌牙签将在 TTC 鉴别培养基上生长的白色小菌落分别点种到 MM甘 培养基和 CM 培养基上。注意点种时，先点 MM 甘培养基，后点种 CM 培养基
5、，并在平皿上做好标记。30培养 24h 观察实验结果。五、实验结果分析1、描述实验结果计算呼吸缺陷性酵母突变率，并分析实验过程中影响诱变效果的因素；2、对比并参照其他小组实验结果，评价本小组实验过程中的利害得失六、数据分析突变率：平板计数法七、思考题1、分析呼吸缺陷型突变株为白色菌落为白色，其它菌株红色、粉红色的机理。2、呼吸缺陷性酵母筛选工作有何现实意义？3、如果白色小菌落分别点种到 MM 甘 培养基和 CM 培养基上培养后都有生长，讨论有哪些原因？实验二 红曲发酵及红曲色素的提取一、实验目的1、了解红曲菌液体菌种的制备方法, 为红曲发酵实验准备液体种子。2、了解固体发酵的工艺过程 , 在实
6、验室中小规模制备红曲。3、熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价的测定方法。二、实验原理 红曲霉菌属真菌界( Eumycophyta)、子囊菌门( Ascomycota)、真子囊菌纲(Euascomycetes)、散子囊菌目( Eurotiales)、红曲菌科( Monascaceae)、红曲菌属( Monascus)。由红曲霉接种于大米发酵得到的红曲是我国古代的一大发明，称为丹曲，至今已有 1000 多年的历史，很早就应用于食品着色、食品发酵以及中医中药。红曲霉作为红曲的生产菌, 以其可产生大量天然色素而著称。红曲的应用主要有三方面：食品色素、药物和发酵食品。红曲色素是红曲霉在
7、生长代谢过程中产生的天然色素，是红曲霉的次生代谢产物，具有热稳定性好，蛋白着色力强，色调柔和，可以提高加工制品对光和氧稳定等优点；而且红曲色素无毒性、无致突变作用，安全性很高，因此红曲可提供安全性高的天然色素。红曲色素分为黄色素、橙色素和紫红色素，其中黄色素包括红曲素(Monascin)和黄红曲素(Ankaflavin)，橙色素包括红斑红曲素(Rubropunctatin)和红曲玉红素(Monascorubin)，紫红色素包括红斑红曲胺(Rubropunctamine)和红曲玉红胺(Monascoru- bramine)。凡色素的呈色都与其结构有着密切的关系，结构的形式与变化内在决定着物质的呈
8、色与变色。大米经红曲菌固体发酵后产生了一系列红曲菌的代谢产物, 但这些产物的量非常少, 大米仍占固体发酵产物的绝大部分体积 , 为了降低运输成本, 常常要对红曲菌的代谢产物进行提取和浓缩。红曲的代谢产物中既有水溶性组分, 也有脂溶性组分, 因此可用 80% 的丙酮(丙酮:水 =80：20)抽提。用 HCl 或 NaOH 处理可以将其中的酸溶性组分、碱溶性组分和中性组分分开。选择溶剂一般要注意以下四点： 溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质溶解度要小，或反之。 溶剂不能与天然药物成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。 溶剂要经济易得，并具有一定的安全性。 沸点宜适中，便于回收反复使用。红色素能
9、溶于 80% 的乙醇中 , 可通过萃取从米粒中提取出来, 红曲色素在 505nm 处有最大的吸收峰, 可用分光光度计来测定。三、实验器材与试剂1菌种：红曲 50032培养基玉米面液体培养基（g/L）：蛋白胨 20；玉米面 20；酵母浸粉 10；硫酸镁0.5；磷酸氢二钾 1；硫酸亚铁 0.1；pH 6.0。发酵培养基：大米培养基3、仪器与设备恒温摇床, 超净工作台, 高压蒸汽灭菌锅、旋转蒸发仪、恒温培养箱等。四、实验步骤1、红曲液体种子制备：配制制玉米面液体培养基。500mL 三角瓶中装玉米面液体培养基 150mL, 包扎后 0.lMPa 灭菌 20 分钟；玉米面液体培养基灭菌冷却后 , 每瓶中
10、接入 1/4 支红曲斜面菌苔 ( 注意无菌操作 )；接种后置 30恒温摇床中 180 rpm 摇瓶培养 3 天。2、固体培养基制备及接种1）浸米 :25 以上浸米 58h, 大米吸收水分约在 28%30% 。2）蒸米: 将浸好的米用清水淋去米浆水, 沥干, 即可蒸米。上汽火力要强, 待全部圆气以后，蒸煮 35min, 出饭率在 135%, 饭粒呈玉色, 粒粒疏松, 不结团块。蒸米不能熟透。3）摊凉接种: 将蒸熟的曲料倒在超净工作台上迅速打碎团块, 摊平冷却到 3032 然后, 每 1kg 米接种液体种子 20ml, 充分翻拌混合均匀,操作要迅速, 以减少杂菌污染。3、红曲固态发酵: 将曲料摊在
11、曲盘内, 厚度约 3-5cm。3233 保温保湿培养。每天翻曲一次，观察到曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点等现象时即可“吃水”, 使曲粒吸收一定水分, 以利菌丝逐渐向内生长。吃水方法: 一边拌曲，一边向曲盘中喷洒无菌水, 使曲粒表面润湿并微有发胀。培养 3 天后米粒逐渐成红色。观察记录色素产生的过程。培养 5-7 天后，固态发酵结束的红曲置于鼓风干燥箱内 5060鼓风干燥。4、成品质量检查外观检查 : 曲粒表层光滑紫红, 曲粒中心呈玉色, 不得有空心和红心。曲粒断面菌丝均匀，具有红曲特有的曲香, 不得有酸气等不正常气味。生物与理化项目检查: 水分 12%以下, 容量 (l00mL)44.
12、546.5g, 淀粉含量 59-62%, 无细菌和其他霉菌污染。5、红曲色素提取：1）取 200g 固体发酵之红曲, 在植物粉碎机中将其粉碎；2）将红曲粉放于 500mL 三角瓶中, 加入提取液(丙酮 : 水 =80:20)300mL；3）室温下浸提 1 天, 每隔 2 小时摇动一次, 过滤；4）沉淀用同样提取液洗涤 2 次, 每次 100ml, 合并滤液；5）在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮( 尚有水分 )；6）用 l mol/L HCl 调残留液(约 l00mL)的 pH 至 3.0, 加至分液漏斗中；7）用 150mL 醋酸乙酯分次抽提；8）以同样方法按下图分离碱(溶)性组分、中性组分和酸(溶
13、)性组分, 观察各组分的颜色；9）将各分离到的组分在旋转减压蒸发仪中蒸去溶剂, 低温保存。五 实验结果分析1、根据实验结果绘制红曲色价生成曲线，分析影响红曲色素合成的因素2、根据红曲色素分离实验结果描述红曲色素组分及特性六、参数测定红曲色价测定：1）称取红曲米样品 0.5g, 放入带有刻度的 lO mL 具塞试管中；2）加入 80%的乙醇 8 mL, 摇匀, 60水浴保温萃取 0.5h；3）取出冷却, 用普通定性滤纸过滤入 lO mL 量筒中 , 用 80% 乙醇洗涤残渣 2 次, 合并滤液, 并用 80% 乙醇定容至 10mL；4）以 80% 乙醇作对照, 在 505nm 波长下, 用 lc
14、m 比色皿测定样品的吸光度。5）计算: 红曲色价(以 lg 样品计)=A 505lO2注意：发酵后期, 若红色素产生量多, 可稀释后测定。七、注意事项 :1. 无水 Na 2S04 可回收, 反复使用, 不要扔掉。2. 有机溶剂易燃, 注意远离火源, 原则上应在通风柜中进行。八、思考题 :1比较固态发酵与液体发酵的优缺点，并指出固体发酵的应用范围。2萃取后米粒中仍带有红色, 是否会对结果产生影响?附：红曲代谢产物分离工艺流程图实验三 苏云金芽孢杆菌的培养及粉剂制备一、 实验目的1、学习苏云金芽孢杆菌的种子制备、发酵生产和产品检测的方法；2、掌握苏云金芽孢杆菌发酵生产的调控原理。二、 实验原理苏
15、云金芽孢杆菌是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，是应用最广的一种微生物杀虫剂，它 的 主 要 活 性 成 分 是 一 种 或 数 种 杀 虫 晶 体 蛋 白 (insecticidal crystal proteins， ICPs)， 又 称 -内 毒 素 ， 对 鳞 翅 目 、 鞘 翅 目 、 双 翅 目 、 膜 翅目 、 同 翅 目 等 昆 虫 ， 以 及 动 植 物 线 虫 、 蜱 螨 等 节 肢 动 物 都 有 特 异 性 的 毒 杀 活性 ， 而 对 非 目 标 生 物 安 全 因 此 ， Bt 杀 虫 剂 具 有 专 一 、 高 效 和 对 人 畜 安 全 等优 点 目 前 苏 云 金
16、 杆 菌 商 品 制 剂 已 达 100 多 种 ， 是 世 界 上 应 用 最 为 广 泛 、 用量 最 大 、 效 果 最 好 的 微 生 物 杀 虫 剂 ， 因 而 倍 受 人 们 关 注 。杀 虫 伴 孢 晶 体 蛋 白 本 身 无 毒 ， 在 酸 性 条 件 下 会 变 性 失 去 作 用 ， 对 于 人 和哺 乳 动 物 ， 当 它 进 入 机 体 后 ， 马 上 在 胃 酸 作 用 下 变 性 ， 而 在 腔 肠 动 物 体 内 ，没 有 酸 性 环 境 ， 不 会 马 上 变 性 ， 在 碱 性 条 件 下 马 上 分 解 ， 释 放 毒 性 蛋 白 ， 起到 对 集 体 的
17、毒 害 作 用 。利 用 发 酵 法 可 实 现 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 的 大 规 模 培 养 ， 最 后 加 工 成 含 有 芽 孢 、伴 孢 晶 体 及 其 他 毒 素 的 粉 剂 。三 、 实 验 材 料一 ） 设 备发 酵 罐 、 摇 床 、 显 微 镜 、 干 燥 箱 、 高 速 离 心 机二 ） 菌 种苏 云 金 芽 孢 杆 菌三 ） 培 养 基 (%)斜 面 培 养 基酵 母 粉 0.5， 蛋 白 胨 1， NaCL 0.5， pH7.0种 子 培 养 基 ：葡 萄 糖 2， 酵 母 浸 粉 0.5， 蛋 白 胨 0.5， K2HPO4 0.1， MgSO4 0.05， 硫
18、 酸铵 0.5， pH7.0发 酵 培 养 基 :葡 萄 糖 3， 酵 母 浸 粉 0.5， 玉 米 浆 1， K2HPO4 0.1， MgSO4 0.05， 硫 酸 铵 1， pH7.0四 、 实 验 步 骤1、 斜 面 菌 种 制 备 ： 接 种 针 挑 取 1 环 原 始 菌 种 ， 于 斜 面 培 养 基 划 线 ， 在 恒 温培 养 箱 30 培 养 24h；2、 液 体 种 子 培 养 ： 挑 取 1 环 培 养 好 的 线 面 菌 株 ， 接 种 到 含 50ml 液 体 种 子培 养 基 的 500ml 三 角 瓶 中 ， 在 200r/min、 30 条 件 下 培 养 12
19、h 左 右 ， 待 菌体 OD 净 增 达 到 0.5 以 上 时 转 入 发 酵 培 养 基 ；3、 发 酵 罐 培 养 ： 配 置 好 发 酵 培 养 基 ， 进 行 原 位 灭 菌 ， 待 培 养 基 温 度 冷 却 至30 时 按 10%种 量 接 入 培 养 好 的 种 子 液 ， 调 节 进 气 和 尾 气 阀 门 维 持 罐 压 在0.5Mpa 以 内 ， 转 速 200-700r/min， 通 气 量 0.8-6vvm， 溶 氧 在 20%以 上 ，温 度 30 ， pH7.0， 过 程 中 流 加 NaOH 或 氨 水 调 节 pH 在 7.0， 培 养 至 菌 体浓 度 在
20、 20 亿 /ml， 90%菌 体 细 胞 形 成 内 生 芽 孢 时 停 止 发 酵 ；4、 粉 剂 制 备取 一 定 体 积 发 酵 液 于 4000r/min 离 心 机 离 心 10min， 弃 上 清 取 沉 淀 ， 于50-60 干 燥 箱 烘 干 即 为 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 粉 剂 。五 、 实 验 结 果 分 析1、 采 用 平 板 计 数 法 计 算 发 酵 液 菌 体 浓 度 并 利 用 细 菌 计 数 器 计 算 芽 孢 形 成 率 ；采 用 平 板 计 数 法 计 算 粉 剂 中 芽 孢 数 量 ,根 据 实 验 结 果 分 析 影 响 菌 体 生 长 及 芽孢
21、 形 成 的 因 素2、 根 据 实 验 结 果 绘 制 时 间 与 还 原 糖 、 溶 氧 、 转 速 、 通 气 量 、 pH 及 菌 体 浓度 的 过 程 曲 线 ， 并 解 释 曲 线 变 化 的 原 因六 、 参 数 测 定 方 法1、 菌 体 OD： 发 酵 液 稀 释 20 倍 ， 采 用 分 光 光 度 计 于 600nm 测 吸 光 值2、 还 原 糖 ： 斐 林 试 剂 法3、 活 菌 计 数 ： 平 板 计 数 法七 、 思 考 题1、 简 述 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 的 杀 虫 原 理 ；2、 利 用 发 酵 罐 培 养 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 过 程 中 ，
22、溶 氧 对 菌 体 生 长 有 何 影 响 。3、 为 了 解 发 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 发 酵 过 程 中 二 氧 化 碳 浓 度 的 变 化 ， 请 设 计 实 验测 定 尾 气 中 二 氧 化 碳 浓 度 的 方 法 ， 并 说 明 实 验 原 理 。附录 发酵液中还原糖的测定方法（亚铁氰化钾快速法）1 试剂与溶液1.1 费林氏甲液称取分析纯硫酸铜(CuSO 45H2O) 15g 及四甲基蓝 (次甲基蓝) 0.05g, 用蒸馏水溶解, 定容至 1000mL。1.2 费林氏乙液称取分析纯酒石酸钾钠 50g，分析纯氢氧化钠 54g 及分析纯亚铁氰化钾4g，用蒸馏水溶解，定容至 1000
23、mL。1.3 0.1%葡萄糖标准溶液精确称取在 105烘 23h 至恒重的分析纯无水葡萄糖 1.000g, 放入100mL 烧杯中, 用蒸馏水溶解, 定容至 1000mL, 为防染菌, 可加 5mL 浓盐酸后再定容。2 测定方法2.1 样品处理及吸取吸取样品 10mL, 用蒸馏水稀释定容至 100mL, 摇匀吸取稀释液 1mL 进行测定。稀释度及吸取量根据含糖量可予增减。2.2 空白滴定精确吸取费林试剂甲、乙液各 5mL 放入 150mL 锥形瓶中, 加蒸馏水10mL。再用滴定管加入 0.1%葡萄糖标准液 9mL。摇匀，在电炉(或煤气灯)上加热, 使其在 2min 内沸腾, 沸腾 30s 后,
24、 匀速滴入 0.1%葡萄糖标准液，至蓝色消失即为终点。记录沸腾前后共耗用葡萄糖液毫升数(A)。2.3 预备滴定精确吸取费林甲、乙液各 5mL, 放入 150mL 锥形瓶中, 加蒸馏水 10mL, 再加 1mL10%样品稀释液。根据样品含糖量的高低(估计数),可用糖液滴定管先加入一定量的 0.1%葡萄糖液(空白滴定耗用葡萄糖液一般在 10mL 以上), 摇匀加热, 沸腾 30S 后, 匀速滴入 0.1%葡萄糖液, 至蓝色消失即为终点, 记下沸腾前后共耗用 0.1%葡萄糖标准液毫升数, 作正式滴定时参考用。2.4 正式滴定精确吸取费林试剂甲、乙液各 5mL, 放入 150mL 锥形瓶内, 加蒸馏水
25、10mL 及 1mL10%样品稀释液 , 再用糖液滴定管加入比预备滴定耗用量少 0.5mL左右的 0.1%葡萄糖标准液, 摇匀后加热, 使其在 12min 内沸腾, 沸腾 30S 后匀速滴入 0.1%葡萄糖标准液，至蓝色消失即为终点, 记下沸腾前后共耗用 0.1%葡萄糖标准液的毫升数 (B)。做平行测定,两次相差不得超过 0.1mL。3 计算(A -B) C还原糖 (以葡萄糖计,g/100mL 或 g) 100(1)W式中： A空白滴定耗用 0.1%葡萄糖标准液数, mLB正式滴定耗用 0.1%葡萄糖标准液数, mLC1mL0.1%葡萄糖标准液含葡萄量 (即 0.001g)W吸取样液相当样品量, mL 或 g。4 注意事项4.1 每批试样测试前必须做空白滴定,二次平行测定误差不得超过 0.1mL。4.2 空白滴定、预备滴定及正式滴定操作条件应保持一致。滴定速度应以每秒 12 滴为宜。热源要稳定,在正式滴定时,待试样沸腾后,标准糖液的滴定量必须控制在 0.51mL 之内,否则要重做。整个滴定过程必须始终保持沸腾状态。4.3 凡样品含糖量在 6%以上时,应适当增加稀释倍数,否则会加大误差。
