1、实验五：大鼠神经元细胞的原代培养2010 级硕士研究生，周二组，严森，122010000178原代培养的细胞会不可避免地存留少量异质细胞一同生长为了后续实验结果的针对性和准确性，一般都需要对培养物进行纯化。纯化神经元的方法有很多种，最简便及常用的是采用有丝分裂抑制剂阿糖胞苷来抑制异质细胞的存活和生长。神经元的分化增殖完成于胚胎期，大部分神经元在出生后即为永久的分裂后细胞，但其他细胞则仍然不断地进行分裂增殖，使用有丝分裂抑制剂后，非神经元的细胞生长会受到抑制及淘汰，神经元由此得到纯化实验材料：Hanks 液，DMEM 培养基 10ml，有刻度吸管两只，弯头吸管两只，无刻度吸管一只，新生乳鼠（24
2、 小时）0.05%胰酶，1% 双抗，10%胎牛血清，培养皿，小烧杯，空的离心管，镊子，剪刀，酒精灯，酒精棉，实验前准备工作：肥皂洗手，新吉尔灭擦手，开通风柜，将吸管从套筒中取出放入各自对应的试管内，将橡皮塞安装到各自吸管上，酒精灯分别迅速灼烧，1 配液 Hanks 液近 40ml 加 1%双抗 1ml，加完双抗的小吸管留作计数，在 DMEM 培养基中加 10%胎牛血清（已配好，全部加入） ，从离心管取一滴碳酸氢钠调节 pH 值至溶液呈紫色，一离心管 0.05%胰酶，2.取材。乳鼠新生 24 小时。3，洗涤剪碎，在培养皿中加入少许 Hanks 液洗涤，将乳鼠头部用酒精棉擦拭消毒，在乳鼠头部位置剪
3、一个工字型切口，将皮肤颅骨沿着切口依次剪开剥离，取出大脑组织，并去除乳鼠的血管脑膜，用弯头吸管将 Hanks 液与剥离干净的脑组织移走到另一个干净的培养皿中，用弯头吸管洗走洗液，弯头吸管将含有脑组织的 Hanks 移入到小烧杯中剪碎，每个组织块近似一立方毫米，静置后洗走上面的 Hanks 液， （吸取 Hanks 液时勿将下面的组织块洗走） ，同样方法再用 Hanks 液洗涤一次4酶解，加一离心管 0.05%胰酶，将上述小烧杯中的组织液移入空置的离心管中，37 摄氏度水浴 10 分钟，观察组织块是否变小，静置 2 分钟，使组织沉淀下来，弃掉上请胰酶后，加 DMEM 培养基（全部倒入）来中和胰酶
4、，吹散组织液5.离心 1200 转每分钟，离心 5 分钟，弃掉上清液，沉淀后加 Hanks 液吹散重悬组织液，用同样的转速和时间在离心一次，加完全培养基 3-4mL 吹散，静置 1 分钟，以便消化大块组织6.计数，取 0.1ml 离心后的细胞液加入苔盘蓝染色，加样抢加 0.1 微升与计数板计数，同时剩余细胞液加入培养瓶中进行培养接种，标注好组别和时间，培养细胞的名称 37 摄氏度，二氧化碳培养箱中，下周实验课观察细胞培养情况。7.计数结果：2.310 6 ml注意事项：1. 实验前保证乳鼠在冰块内冰冻数分钟，头朝下将乳鼠插入冰块内，2. 玻璃脑膜血管时动作要迅速，以免乳鼠苏醒3. 酒精灯应放在离操作界面不远处，保证其温度4. 用弯头吸管吸取 Hanks 液时手腕旋转5. 第二遍在小烧杯中用 Hanks 液洗时，要保证上请洗干净，否则胰酶浓度将会减低6. 第一次水浴加热时唔超过 10 分钟，以免胰酶对组织产生损伤7. 吹打时避免大力以及吹打出气泡，气泡会导8. 致细胞破裂。吹打频率可与秒表同步以保证每次操作的稳定性和重复性。
