1、2012-2013 学年第 1 学期 生命科学 学院期末考试卷手性药物及其制备技术学号: 201074050129 姓名: 王 婷 班级: 2010 级制药工程（1）班 成绩：评语：（考试题目及要求）：见附页 半合成葡聚糖硫酸盐作为潜在的新型抗栓药物：综述苏珊阿尔班*和格哈德弗朗茨Institute of Pharmacy, University of Regensburg, Universita tsstrasse31， 93040 Regensburg, Germany2001 年 2 月 8 日由结构定义的半合成葡聚糖硫酸盐综合开发出的新型抗血栓药被作为潜在的肝素替代品。葡聚糖由于其不同
2、的自然起源，被用作起始聚合物，由此产生的葡聚糖硫酸盐表现出明显的抗凝血作用；其中有的活性等同于肝素。通过研究其构效关系表明，除了分子量（MW）和硫酸化程度（DS） ，硫酸化方式和多糖的基本结构也是硫酸化多糖抗凝血作用的重要参数。它们的作用方式与肝素不同。其根据各自的结构，干扰不同阶段的凝血过程。在体内，它们表现出部分类似于肝素的抗血栓活性。然而，其在体内的抗血栓作用并不仅仅基于它们的抗凝血活性。葡聚糖硫酸盐纤溶酶的活性和其强大的 TFPI 释放效应也可能有助于这种作用。由于硫酸化多糖与凝血系统多方面的相互作用，使每个葡聚糖硫酸盐显示出依赖于其各自结构的作用方式。研究硫酸化葡聚糖发现，DS 1.
3、0，分子量为 18 和 50 kDa，主要为 C2-和 C4-硫酸化的，线性 -1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐最适合作为潜在的肝素替代品。这个研究结果证明了硫酸化多糖的各种结构参数对其抗血栓活性的影响。然而，硫酸多糖的生理作用不只限于凝血，对其他生物系统也具有多方面的调节作用。因此，使用复杂的糖类药物设计的方法，可能会获得具有特殊作用方式的新药。1.引言 60 多年来，糖胺聚糖肝素一直是预防和治疗血栓栓塞性疾病的首选药物。然而，其还存在着明显的有关临床应用上的问题，例如，它对抗凝血酶（AT ）缺陷患者的治疗是无效的，并可引起出血并发症，还可以导致肝素诱导的血小板减少的症状（1） 。此外，肝素还显示
4、了由于其结构参数的变化而导致的生理活性的变化（2） 。从动物组织中分离的肝素，可能会导致严重的污染，例如，会引发疯牛病的朊病毒。另外，由于肝素使用在全球的不断普及，天然来源的肝素可能不足以满足今后人们的需要。因此，研究有效的替代品来代替肝素是现在一个重要的研究领域。而硫酸化多糖的化学性质可能与肝素相关。这些化合物引人注目的另一个原因是人们对其多种生物活性的不断了解。除了抗凝血和抗血栓作用（3） ，还发现了其抗动脉粥样硬化（4） ，抗增殖（5） ，防粘（6） ，抗血管生成（7,8） ，抗炎（9，10） ，抗补体（11）及抗病毒（12）等作用。目前，有一个特别有趣的问题即这些额外的活性是否或者在何
5、种程度上支持肝素的治疗效益。利用肝素治疗的肿瘤患者的生存时间延长的多少被认为与肝素的抗增殖，抗血管生成和抗转移作用有关，此外，肝素的抗补体活性和潜在的抗炎活性可能主要在体外循环期间发挥作用（13） 。因此，硫酸多糖类似于甚至优于肝素的作用方式是一个很有前景的研究领域。这些化合物广泛存在于自然界。它们作为胞外基质的成分，主要存在于脊椎动物的细胞表面和某些海洋生物中。然而，大多数天然的硫酸多糖是多分散性大分子混合物的复合体，而且在它们的结构和生物活性方面有很大的差异。这使得任何天然聚合药物的开发利用变得复杂。结构定义的半合成硫酸多糖的构效关系可能更适合用于研究并建立其最佳结构来作为肝素替代品。2.
6、起始聚合物的硫酸化半合成硫酸多糖的一个重要的前提是选择合适的多糖。他们应该是一应俱全，价格低廉并且化学定义明确。凝胶多糖和海带多糖（-1,3-葡聚糖） 黄原胶普鲁兰糖 木葡聚糖图 1 天然葡聚糖作为半合成硫酸化葡聚糖的起始多糖 例如，-1 ，3 - 葡聚糖凝胶（图 1） ，其满足所有这些要求。这种长链聚合物是最初从土壤中的非粪产碱菌中发现的一种胞外多糖（14） 。通过发酵方法，其被大量生产用于食品工业和其他工业。除了凝胶多糖，还可选择短链（5.6 kDa）的棕色藻类 -1 ，3 -海带多糖（图 1） 。这种储备多糖高达藻类干重的 50 。通过研究由黑酵母出芽短梗霉发酵产生的直链的，中性普鲁兰多
7、糖（-1 ，4/1 ，6 葡聚糖） （图 1 ）来评估糖苷键类型对生物活性的影响。这种胞外多糖如凝胶多糖是一种重要的聚合物，其在食品，化妆品，医药等行业有多方面应用（15） 。为比较直链的硫酸多糖与其带支链的衍生物的作用，将凝胶多糖的 6 位分别用葡萄糖，龙胆二糖，鼠李糖，和阿拉伯糖取代（3,16） 。此外，有两种众所周知的天然的带支链的葡聚糖被作为起始聚合物：一种是长链的细菌多糖黄原胶（野油菜黄单胞菌） （图 1） ，其-1 ，4 - 葡聚糖主链上每两个葡萄糖单元被一个三糖单元所取代（由 -D -甘露糖-6 - 乙酸酯， -D-葡糖醛酸和 -D-甘露糖-4,6 - 丙酮酸缩酮组成） （17,
8、18） ；另一个是 Glyloid 3S（大日本制药，大阪，日本） ，一种从罗望子种子（19）中分离出的高度支化的短链木葡聚糖（图 1） 。葡聚糖硫酸盐的分子量（ MW）是采用凝胶渗透色谱法（GPC ）通过测定其流体动力学体积来测定的。这不仅依赖于起始聚合物的链长，还依赖于硫酸化反应的条件。此外，它还随起始聚合物的温度（20）或超声波（21）的降解而发生变化。多分散性产品由 GPC 分馏后得到小分子量范围内的化合物。3.葡聚糖硫酸盐的合成起始葡聚糖的硫酸化通常是将三氧化硫- 吡啶配合物溶解在 DMF 中进行的。将这种配合物逐步加入多糖中溶解或微细悬浮于含有与吡啶等摩尔的硫酸化试剂的 DMF 中
9、。这个程序在 LARM 等（22）所描述方法的基础上被修改和优化后，产生重现性好，高度硫酸化的非降解多糖衍生物（23） 。葡聚糖硫酸盐的硫酸化程度（ DS ，即，每个葡萄糖单体中所含的硫酸基团）被证明与其温度，反应时间和过量的硫酸化试剂有关（16,23,24） 。而关键的一步则是预处理，即，多糖的活化，如凝胶多糖-钠配合物的形成。另外，多糖的结构基础对其硫酸化程度也有很重要的影响。例如，与相应的长链凝胶多糖衍生物相比，经过相同的硫酸化程序产生的硫酸化海带多糖具有较高的 DS。由于普鲁兰糖中 -1，6-糖苷键上只含较少比例的游离伯羟基，而使 -1,3-葡聚糖比普鲁兰糖更容易进行硫酸化。图 2.
10、凝血级联反应与凝血功能检查，记录这个过程中的不同阶段（为避免复杂性，正反馈循环，如FXI 活性，凝血酶辅助因子 V 和 VIII 的活性以及内在和外在的经典分化途径没被显示出来，详解请看文献 65） 。通过应用这种硫酸化方法，主要使葡萄糖六位上的伯羟基被取代。为了检测除了硫酸化程度，葡萄糖单元上硫酸基团的位置对其生物活性是否也有影响，而用不同的硫酸化方式生成 -1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐。为了降低羟基在 2 位和 4 位的二次硫酸化，而使 6 位在硫酸化之前就被保护。比较各种保护基团（16）发现，adamantoyl 残余物（25）可使产物的 2 位和 4 位（19）的硫酸基达到 97 。4.
11、葡聚糖硫酸盐的抗凝血活性 为了检测新型葡聚糖硫酸盐的抗凝血活性，对经典凝血试验（26）的凝血酶原时间（PT)，活化部分凝血酶时间（APTT） ，TT 进行了测定并做了抗 Xa 因子的凝血试验（ Heptest ） 。以普通肝素作为参考，并用第四国际标准肝素（第四 I.St ）测定其特定的抗凝血活性（单位/毫克） 。由各种凝固实验记录了凝血过程中不同阶段的相互作用（图 2） ，从而得知新型葡聚糖硫酸盐提供了抗凝血（27）作用的基本信息。PT 定了干扰外源性和内源性凝血途径的APTT。在 TT 则测定其最后一步凝血过程，即凝血酶介导的纤维蛋白的形成。Heptest ，尤其是在肝素的开发中，需测定其
12、抑制因子 Xa。相比于无活性的非硫酸化的葡聚糖，硫酸化衍生物在所有这些测定中都表现出抗凝血作用。它们各自的活性范围由不到肝素活性（3,16,24）的 1 到肝素活性的 135 都取决于其各自的结构。在活化部分凝血酶时间（APTT） 和凝血酶时间（TT）内，葡聚糖硫酸盐表现出其最高的活性。肝素主要通过催化 Xa 因子和内源性凝血酶抑制剂 AT（28）而起抑制血液凝固的作用。在 Heptest 中，葡聚糖硫酸盐的活性只有肝素活性的 10。因此，关于 Xa因子，葡聚糖硫酸盐不存在类似于肝素的作用机制。由于缺乏本测定法的特异性，葡聚糖硫酸盐在 Heptest 中的活性仍很弱。Heptest 并不是只能
13、用来测量抗 Xa 因子的活性，其还可用于测定抗凝血酶的活性，并在一定程度上影响其内源性凝血作用（29） 。同肝素一样（30） ，葡聚糖硫酸盐较弱的 PT 活性表明，外在部分的凝血作用并不是葡聚糖衍生物的重要作用。5.构效关系 对构效关系的广泛研究发现，半合成葡聚糖硫酸盐的抗凝血活性与它的一些结构参数有关。一个确定的最小电荷密度以及最小链长对任何抗凝血作用都是必不可少的。这些阈值和各多糖的基本结构都是互为条件的。短的直链 -1 ，3 -葡聚糖硫酸盐，即，硫酸化海带多糖，要求其 DS 大于 0.7 时才具有抗凝血活性（23） 。与此相反，高分子线性 -1 ，3 -葡聚糖硫酸盐只需 DS 为 0.5
14、 就具有活性 。例如，DS 为 0.54，分子量 190 kDa 的硫酸化凝胶多糖在 APTT 和 TT 内，其活性达肝素的 28。DS 低于 0.7 时，带支链的，短链 -1 ,3-葡聚糖仍具有活性（16） 。相应地，DS 为 0.66，分子量 15 kDa 的阿拉伯糖支链上的 -1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐，在 APTT 内的活性表现出肝素活性的 11 ，而在 TT 内的活性只有肝素的 6 。硫酸化普鲁兰糖只需更小的 DS 即有活性（31） 。在这里，DS 为 0.17，分子量 48 kDa的化合物在 APTT 内的活性达肝素活性的 5，而在 TT 内的活性达肝素的 8 。由此可得到一般规律
15、，即所有试验中的凝血活性都随着葡聚糖硫酸盐 DS 的增大而提高（3,23,24,31） 。抗凝血活性的第二个决定性参数是该聚合物的链长（20） 。平均分子量越大，其抗凝血作用就越强。当分子量超过 150kDa 时，其活性不再增加。特别是凝血酶原的活性，对这个参数有强烈的依赖性：最小 MW 的凝血酶原在 TT 内的活性比其在 APTT 内的活性都高，但高分子化合物在 TT 内的活性也能超过其在 APTT 内的活性。DS 为 1.05 的硫酸化 -1 ,3-葡萄糖在 APTT 内的活性相当于肝素活性的 20 ，而这在 TT 检测时则完全无效。相反，含有相同 DS，分子量约 250kDa 的硫酸化凝
16、胶多糖，在 TT 和 APTT 测定时的活性均为肝素活性的135%。由此得到结论，DS 为 1.0 的肝素，其 TT 活性与 APTT 活性的比值随葡聚糖硫酸盐分子量的增加而增大。葡聚糖硫酸盐各自 DS 和分子量之间的关系及其抗凝血活性是从被报道的其他硫酸化多糖包括硫酸化褐藻多糖（32,33） ，硫酸葡聚糖衍生物（34）和硫酸皮肤素（35）等中发现的。除了 DS 和 MW，硫酸化方式对硫酸多糖的抗凝血活性也很重要。这已被证明“选择性地”用于 - 1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐中（36） 。近期，硫酸化褐藻多糖和硫酸皮肤素也被报道出类似的结果（37，38） 。硫酸基团在葡萄糖碳原子上的分布不仅影响其
17、活性，也影响其作用方式。与具有相同 DS 和分子量的 -1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐相比，其抗凝血活性的提高依赖于硫酸基团在 2 位和 4 位所占的百分比。而要通过硫酸化修饰产生活性，通常需要更高的 DS和分子量。如图 3 中所示，活性的增强与 DS 和分子量（MW）有很大关系。产生的低 DS，分子量 20 kDa 的 -1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐的多少大多取决于硫酸基团在 2 位和 4 位所占的百分比。此外，DS 和 MW 决定了在不同实验中活性增加的程度。因此，-1,3 -葡聚糖硫酸盐表现出的不同的作用方式与他们的 DS ，分子量，和硫酸化方式有关。以 C6 硫酸化为主，低 DS 或低 MW
18、 的化合物，在 TT 实验中没有显著活性，而以 C2 和 C4 硫酸化为主的化合物在本实验中则有显著的活性。在低 DS 以及低 MW 的化合物中，APTT 和 Heptest 活性通过 C2-和 C4硫酸化作用而增强，这对 TT 活性则没有显著的影响。图 3. 关于主要以 C6-（GS-6)及主要以 C2-和 C4-硫酸化的 - 1，3- 葡聚糖（GS -2 ，4）硫酸盐的 APTT （黑色框） ，TT（斜线框）和 Heptest（白色框）活性之间的比较。根据他们的 DS 和分子量，化合物被分为四组。为了表明其活性变化，将 GS-6 各自的 APTT 活性作为起始活性U /毫克并将其定义为1。
19、此外，带支链的 -1,3 - 葡聚糖硫酸盐是比具有相同 DS 和 MW 的线性化合物更有效的抗凝血剂。其 TT 活性一般较高，而 APTT 活性的变化则依赖于碳水化合物的侧链（例如，单糖或二糖，戊糖或己糖，或脱氧糖）及其支链化程度（DB） 。糖苷键的取代增强了聚合物链的活性，而这种活性增强的作用可能基于其与抗凝血酶抑制剂之间相互作用的增强。对天然带分支的葡聚糖硫酸盐的研究结果证明了这些一般有效性。带有三糖侧链的硫酸化黄原胶的APTT 活性相对较弱，但其 TT 活性却是相应线性葡聚糖硫酸盐的近 4 倍（图 4） 。在龙胆二糖中，-1,3 - 葡聚糖硫酸盐的支链上的也观察到了类似的活性变化。高度支
20、化的（DB0.75）硫酸化木葡聚糖略微降低的 APTT 活性和增强约 5 倍的 TT 活性与 DB 0.70 的-1,3 - 葡聚糖硫酸盐的活性相一致。图 4. 关于直链和支链硫酸化葡聚糖的 APTT 活性和 TT 活性之间的比较（通过测量第四 I.St.，普通肝素的 APTT 和 TT 活性为 150 U /mg）：（ A）长链的硫酸化葡聚糖，硫酸化凝胶多糖（ CURS ）和黄原酸硫酸盐（ XanS ） ；（B）短链葡聚糖硫酸盐，硫酸化海带多糖（ LAMS）和硫酸化木聚糖（ XyglS ） 。图 5. 相同 DS 和分子量的 - 1，3 -葡聚糖硫酸盐 和 -1 ，4/1 ，6 - 葡聚糖硫
21、酸盐的APTT（9）和 TT 活性（0） U / mg（毫克）的比较（通过测量第四 I.St.，普通肝素的 APTT 和 TT 活性为 150 U /mg） 。带支链的葡聚糖硫酸盐的活性变化表明除了电荷密度，聚合物大小和取代方式，链的灵活性和其空间结构也是硫酸多糖和凝血酶相互作用的重要决定性因素。因此，多糖主链上糖苷键的类型，不仅决定其形成，也影响其活性。如图 5 中所示，硫酸化普鲁兰糖的 APTT 活性和 TT 活性都优于硫酸化凝胶多糖。此外，其 TT 活性到 APTT 活性的比率也比硫酸化凝胶多糖高。这些数据表明，- 1，4 - / 1，6 -葡聚糖的结构对凝血酶介导的纤维蛋白的形成造成的
22、干扰比 -1 ，3 - 葡聚糖造成的干扰更大。由所建立的构效关系证明，半合成葡聚糖硫酸盐抗凝血活性定量和定性的变化都依赖于其结构。由此得出结论，由于带负电荷，这些新型肝素对非特异性凝血过程无抑制作用，但他们会干扰凝血级联反应的各个阶段，由此表明这些相互作用对化学结构有不同的要求。6.作用方式通过调查新型的半合成葡聚糖硫酸盐的作用方式发现它们的抗凝血机制与肝素有显著差异。在用纯化酶和显色底物进行酰胺分解实验时，葡聚糖硫酸盐即没表现出直接作用，也没表现出 AT 介导的抑制 Xa 因子的作用（40） 。在相应抗凝血酶的检测中，其作用则很明显，但 -1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐最活跃时的 IC50 仍然
23、高于肝素约 15 倍（40） 。当其 TT 活性与肝素活性相同时， AT 介导的凝血酶抑制作用可能有助于它们的抗凝血活性，但不起主导作用。作为一个实用性的结果，这些化合物对 AT 缺陷的患者也有作用。葡聚糖硫酸盐的一个重要作用位点是内在因子 Xa 的生成，即，由 IXa 因子，辅因子VIIIa，磷脂，和 Ca2 + （参见图 2 ） （40）组成的 tenase 复合物对 X 因子的激活。这一步的抑制作用可能解释了葡聚糖硫酸盐在 APTT 内的高活性。与 APTT 活性相似，相比于分子量，葡聚糖硫酸盐的抑制作用更多地依赖于 DS。例如，APTT 活性很高 ，而 TT 活性却很低的高度硫酸化的，
24、短链 -1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐，也是内在因子 Xa 产生过程中有效的抑制剂。这些结果与乳糖酸衍生物的抗凝血作用类似，它代表了分子量小于 3 kDa 的高度硫酸化的碳水化合物的衍生物（41） 。硫酸化乳糖酸抑制其在 APTT 内的高活性和内在因子 Xa 的生成测定，但其在 TT 检测中影响不大。进一步研究葡聚糖硫酸盐在内在因子 Xa 的生成过程中产生的抑制作用的机制发现，这些化合物通过凝血酶分别抑制辅因子 VIIIa 或其活性，并因此抑制了 FX 活化的 tenase 复合物的形成（24） 。在外源性凝血因子 Xa 的生成实验中，主要通过组织因子/凝血因子a 的复合体使 X 因子活化，而葡聚
25、糖硫酸盐的活性则大大减弱。而从中观察到的抑制作用则归因于所谓的“ Josso 循环” ，即外源性和内源性凝血系统之间的联通（42） ，而不是直接干扰外源性凝血因子 Xa 的生成。Xa 因子通过形成一个由辅助因子 Va，磷脂和 Ca 组成的复合体执行其生理功能（43） ，2即通过凝血酶原酶将凝血酶原转变为有活性的凝血酶。葡聚糖硫酸盐只适度的抑制凝血酶原酶的活性（40） 。而这些抑制作用仍强于那些游离的 Xa 因子。葡聚糖硫酸盐的活性导致凝血酶的生成减少，这代表了血栓形成中的关键过程。但凝血酶本身的作用被拮抗并通过 TT 活性反映出来(44)。葡聚糖硫酸盐显著的 TT 活性对结构的要求与 APTT
26、 活性不同。一个分子三维空间的大小似乎对任何活性都是至关重要的。这可以通过一长链分子或带支链的糖苷分子来实现。硫酸化方式和糖苷键类型还存在其他显著的影响,即通过葡聚糖硫酸盐抑制凝血级联的最后一步反应（图 6） 。图 6. 半合成葡聚糖硫酸盐在凝血酶介导的纤维蛋白的形成过程中的作用位点。各种机制对凝血级联反应最后一步的抑制作用依赖于葡聚糖硫酸盐各自的结构参数。其凝血酶作用（粗箭头）与发色底物（在体外）的酰胺分解作用和其纤维蛋白原裂解而生成纤维蛋白（体外和体内）的作用不同。硫酸盐的作用：（）活化；（） 捆绑：（|）抑制。葡聚糖硫酸盐不能直接减弱发色底物的酰胺分解。 肝素辅助因子 II（HCII）也
27、具有重要的作用(45),与 AT 相似，其是一种经硫酸化多糖催化产生的内源性凝血酶抑制剂。糖胺聚糖硫酸皮肤素的抗凝血作用是典型的 HCII 介导的凝血酶抑制作用(45)。葡聚糖硫酸盐的 MW 和 DS 越大，HCII 介导的凝血酶抑制作用就越强。高度硫酸化的，长链硫酸化黄原胶是活性最强的 agent，其活性甚至优于对照化合物硫酸皮肤素的活性（24） 。硫酸化黄原胶的 IC50 是硫酸皮肤素的约 1/1000 倍，而它能使 HCII 介导的凝血酶抑制作用增加 10000 多倍。正如前面提到的，葡聚糖硫酸盐只轻微加快了 AT-介导的凝血酶抑制作用。这是预料之中的，因为它们不含有 AT-结合位点和肝
28、素特定的五糖序列。然而，有一个例外：与肝素具有相同活性的硫酸化普鲁兰糖在纯化的 AT-凝血酶的测试系统中则表现出相当低的 TT 活性（24） 。到目前为止，还没有发现合适的化合物。根据综合研究发现，硫酸化普鲁兰多糖既不能和 AT 单独结合，也不能和凝血酶单独结合，但他们似乎已经凭借肝素的“模板”机制提出了 AT-介导的凝血酶失活作用（46,47） 。葡聚糖硫酸盐不能通过凝血酶直接抑制显色底物的酰胺分解（40） ，这表明通过做特定的凝血酶抑制剂如 argatroban 而干扰凝血酶的活性中心，并不能使其失活（48） 。而用大分子纤维蛋白原做底物时，则可使凝血酶的作用减弱（40,49） 。只有主要
29、以 C2-和 C4-硫酸化的 - 1，3-葡聚糖硫酸可以通过这种方法直接与凝血酶结合并发挥抑制作用（24） 。然而，具有一定 DS 和 MW 的，所有类型的葡聚糖硫酸盐都能与纤维蛋白形成配合物（49） 。这可能会造成纤维蛋白聚合物的空间位阻，如同以上描术的硫酸化褐藻聚糖一样（50） 。由于葡聚糖硫酸盐依赖于其各自结构的抗凝血作用，可能会产生具有特殊作用的肝素。HCII 介导的凝血酶的抑制作用代表了这些化合物的一大优势。而用药过量与 HCII 有限的生理活性无关。因此，他们的抗凝血作用应该是低于那些直接抑制凝血酶或抑制通过 AT 介导的凝血酶的化合物（马斯特里赫特教授的个人见解） 。7.抗血栓作
30、用在已建立的动物血栓形成模型中检测葡聚糖硫酸盐活性，以确定这些体外抗凝血剂是否也表现出体内抗血栓活性。结果证明这或多或少的作用依赖于它们的结构。硫酸化凝胶多糖（ DS 为 0.83，分子量为 49 kDa）在 2 位和 4 位的硫酸基占 75 时，其活性与肝素在诱导大鼠模型的颈静脉血管闭塞而产生血管梗阻时的活性相同。然而，在体外，其活性较肝素低3-4 倍。这表明，体外抗凝血剂并不总是能表现出体内抗血栓的作用，这些额外的活性也可能有助于他们的活性。除了抑制血浆凝结，主要以 C2-和 C6-硫酸化的 - 1 ，3-葡聚糖硫酸盐还有抑制凝血酶诱导的血小板聚集的作用。此外，葡聚糖硫酸盐还能促进纤维蛋白
31、在体外的溶解和拮抗剂的凝固。酰溶酶活性有助于许多肝素如硫酸皮肤素，戊聚糖多硫酸酯或硫酸化褐藻多糖等的抗血栓作用。由于凝血功能，在葡聚糖硫酸盐和这种复合体系之间也发现了依赖于其结构的相互作用。他们激活接触系统，从而促进体内纤维蛋白的溶解。此外，它还能促进组织型纤溶酶原激活剂（ t-PA 的）介导的纤溶酶原的活性并能增强水解纤维蛋白的关键酶即酰胺水解酶的活性。然而 ，它们不能降解纤维蛋白或直接激活纤维蛋白溶酶原，而是借助 t-AP 来发挥其活性。除了这些体外现象，葡聚糖硫酸盐也能释放来自血管壁的类似于肝素的 t-PA（见下一节） 。这一作用可能有助于肝素的整体抗血栓作用。在 APTT 内的抗凝血活
32、性 在 TT 内的抗凝血活性纤维蛋白平板法测得 离体灌注猪耳模型实验 的体外纤溶酶活性 中 t-PA 的释放效应 图 7 关于四种 4 种葡聚糖硫酸盐 XanS（硫酸化黄原酸） （黑色框） ，CurS（硫酸化凝胶多糖） （浅色框） ，LamS9（硫酸化海带多糖） （深色框）和 PulS（硫酸化普鲁兰糖） （白色框） （见表格 1 中的结构参数）在 APTT 和 TT 内的抗凝血酶活性，用纤维蛋白平板法测得的体外纤溶酶活性和离体灌注猪耳模型实验中t-PA 释放效应的比较。葡聚糖硫酸盐的另一个作用只发生在体内，即释放来自血管壁的组织因子途径抑制物（ TFPI） 。TFPI 是一种内源性丝氨酸蛋白酶
33、抑制剂，具有抑制组织因子介导的凝血作用。TFPI通过静脉和皮下注射肝素后的转移被认为参与葡聚糖硫酸盐的抗血栓作用。在用猴子进行实验时发现，主要以 C2-和 C4-硫酸化的硫酸化海带多糖的活性比肝素强。由此证明，TFPI 的释放对 - 1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐的抗血栓活性也有重要的影响。8.比较体外抗凝血活性，体外纤溶酶作用和 t-PA 的释放在体内的影响葡聚糖硫酸盐依赖于其结构的作用方式并不只局限于其抗凝血作用，也发现了其他生物活性。这可以通过比较 4 种葡聚糖硫酸盐的 APTT 活性和 TT 活性，体外纤溶酶活性和 t-PA的释放能力而得以证明（图 7） 。这四种化合物的结构参数列于表 1
34、 中。他们的抗凝血活性反映了其复杂的构效关系，这在第 5 部分中作了详细探讨。普鲁兰糖由于其相对较低的 DS，抗凝血活性最低。长链的硫酸化凝胶多糖及短链的硫酸化海带多糖的APTT 活性和 TT 活性证实葡聚糖硫酸盐的活性随其分子量的增加而增强，尽管硫酸化海带多糖的 DS 很高。虽然硫酸化黄原胶的 DS 和 MW 都很大，但由于其较高的 DB，在 TT 检测中表现出与肝素相同的活性，而其 APTT 活性却不是很高。利用传统的纤维蛋白平板法可以对纤溶酶活性剂进行简单的筛选：首先在培养皿中涂覆添加了凝血酶的人纤维蛋白原溶液。然后将溶解的化合物试样等分放置在平板上，并测定所得到的分解区域。如果高度纯化
35、或遇热易失活的纤维蛋白原被分解，则说明葡聚糖硫酸盐不诱导任何化合物的溶解。如果纤维蛋白原中含有一些血纤维蛋白溶酶原和 t-PA，则表现出纤维蛋白溶酶原酶的活性，此时肝素则失活。与抗凝血活性相反，葡聚糖硫酸盐的活性强烈地依赖于 DS，而与 MW 无关。这是通过硫酸化凝胶多糖和硫酸化海带多糖之间的差异以及普鲁兰多糖的低活性所表现出来的。在该实验中，葡聚糖硫酸盐的基本结构也起着很重要的作用。尤其对以 -1 ，3-葡聚糖为基础结构的衍生物起至关重要的作用，而带支链的黄原酸硫酸盐的活性却不是很强。表 1.通过黄原胶，凝胶多糖，海带多糖和普鲁兰多糖而获得的葡聚糖硫酸盐的结构参数(a）葡聚糖硫酸盐 多糖结构
36、基础 硫酸化程度(DS) 分子量（MW，kDa）硫酸化黄原胶 带支链的 -1,4-葡聚糖 1.60 160硫酸化凝胶多糖 -1,3-葡聚糖 1.30 120硫酸化海带多糖 -1,3-葡聚糖 1.60 17硫酸化普鲁兰糖 -1,4/1,6-葡聚糖 0.50 95通过向每摩尔葡萄糖中加入 6 摩尔过量的 SO3吡啶配合物而表现出硫酸化作用；有关详细信息，请参阅文献 16,21,23 和 24。DS =每单糖单元中所含的硫酸基，MW =以中性酶作为标准，通过 GPC 测定其流体动力学体积而确定分子量 利用猪耳模型的离体灌注实验来检测 t-PA 的释放能力。从屠宰的新鲜猪的耳动脉中间支灌注 tyrod
37、e buffer 缓冲液。漂洗 30 分钟后，在 2 分钟的馏分中收集灌流液。 4 馏分后即获得基线，用含有待测化合物的缓冲液在猪耳朵中灌注 4 分钟，然后再用 buffer 缓冲液灌注 12 分钟。馏分中 t-PA 的浓度决定了相应的基线。比较四种葡聚糖硫酸盐发现，他们的活性随 MW 的减小而持续降低，与其 DS 和基本结构无关。然而硫酸化程度较低的硫酸化普鲁兰糖却比高度硫酸化的硫酸化海带多糖更加活跃。四种葡聚糖硫酸盐活性的变化证明了他们之间构效关系的不同。总之，葡聚糖硫酸盐依赖于其各自结构的作用方式干扰凝血过程和纤溶过程。9.结论化学结构定义的半合成葡聚糖硫酸盐被开发并首次在体外被检测到。
38、从而建立其构效关系。通过对其作用方式的调查表明，这些化合物能干扰凝血级联反应中的几个阶段。在体内，部分化合物显示出类似于肝素的抗血栓活性。然而，体内的抗血栓作用不只基于它们的抗凝血活性。其纤溶酶活性和强大的 TFPI 释放能力也可能有助于这种作用。由于其与凝血系统多方面的相互作用，使每个葡聚糖硫酸盐都显示出依赖于各自结构的作用方式。对葡聚糖硫酸盐进行研究发现，DS 1.0，分子量为 18 和 50 kDa，主要以 C2-和 C4 -硫酸化的，线性-1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐最适合作为潜在的肝素替代品。凝胶多糖的起始聚合物的实用性和其结构常数似乎优于任何其他葡聚糖。与带糖苷支链的 -1 ，3 -
39、 葡聚糖硫酸盐不同，主要以 C2-和 C4-硫酸化的，线性衍生物则可以合成，并可以被标准化。这种化合物被证明在体内其活性最高。此外，他们还显示出一种简洁的的作用方式包括与凝血酶的直接作用。 HCII 介导的凝血酶抑制作用的显著增强，大多与 AT，被标记的纤溶酶活性和 TFPI 强烈的活化作用无关。它们在体内是无毒的，且有良好的耐受性。多数情况下，分子量 50 kDa 的 -1 ，3 - 葡聚糖硫酸盐在体外活性更高，而那些分子量较低的葡聚糖硫酸盐的生物利用度却更高。这个研究结果表明了硫酸多糖的各种结构参数对其抗血栓活性的重要性。然而，硫酸多糖的生理作用不只限于凝血，在没有毒性的情况下，对其他生物系统也具有多方面的调节作用。因此，使用复杂的糖类药物设计的方法，可能会获得具有特殊作用方式的新药。
