1、PCR技术及其发展和应用,张雪梅 检验系临床生化教研室,主要参考书,CW迪芬巴赫 、GS德弗克斯勒美主编 。PCR技术实验指南黄留玉主编。PCR最新技术原理、方法及应用尹一兵主编。分子诊断学,目 录,PCR技术的原理 PCR技术的衍生技术 实时荧光PCR技术 PCR技术的应用,一、PCR的基本原理,PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DN
2、A加倍,MOVIE,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2
3、轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2nn 循环次数实际拷贝数=(1+x)nX 平均效率,约为0.85n 循环次数,PCR技术简史,核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR的完善,PCR技术简史,核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR的完善,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 然而，采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错,PCR技术简史,核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR的完善,1988年初，Keo
4、hanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪,实验步骤,（1）在0.5ml PCR管内配置20ul反应体系：,（2）PCR反应程序,(1) 94变性5min，(2) 94变性1min， (3) 52 退火1min，(4) 72 延伸1min。(5) 72 延伸10min。
5、,重复(2)-(4)30次,PCR结果：1、对照(无模板)； 26、PCR产物（5ul样品）,PCR产物的电泳鉴定,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,（1）模板 单、双链DNA均可，多种来源。 质量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般人基因组100ng DNA模板（100L）。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR反应的影响因素 1)反应体系,Lambda DNA，模板量分别为100 pg, 10pg, 1pg, 100fg , 10fg,（2）引物引物是与待扩增DNA片断两翼互补的一段特异的寡核苷酸片断。引物是P
6、CR反应中最关键的因素，因此引物序列的设计对于PCR是否成功是非常重要的。,引物设计的原则： （1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。,序列的查找可在相关的网址，如http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed 查找各种目的序列。 同源性比较可以在www.ncbi.nih/blast.cgi进行在线比较或通过OMIGA、Clustal X等软件进行两两或多序列的比较。,引物序列同源性比对,（2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构（发夹结构）。 （5）两引物间避免有互补序列（二聚体）。
7、（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记,引物设计,引物设计常用软件主要有： Primer Premier 5.0 Oligo 6 primer 3 The Primer Generator Net Primer,1. 将序列输入软件中,两个方法,（2）打开原有的序列文件,在对话框中输入待扩增序列点击左上角的“Primer”按钮,2. 设置相关参数,3. 得到的引物结果,Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构 Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体 False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否
8、有配对 Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体,改动后引物的信息,重新回到双引物的界面,“Edit”“Copy”“Sense Primer” 5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3,4. 输出引物序列,引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC 纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。普通PCR：OPC纯（95%）较长引物（大于50个碱基） ：PAGE纯（95%）经过修饰或标记的引物：HPLC纯（ 99%,但价格昂贵） 引物浓度：0.1-0.5 mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。,*生物科技有限公司的引物合成服务,
9、（3）耐热DNA聚合酶,1）Taq DNA聚合酶（Taq polymerase） ： 95的半寿期为40min 最适温度（72）时每个酶分子每秒可催化合成150个核苷酸 酶活性（受多种因素影响）： 53方向的聚合酶活性， 53方向的外切酶活性和逆转录酶活性， 非模板依赖性活性，可在双链PCR产物每一条链的3端加上单核苷酸尾，使PCR产物的3端突出一个单A核苷酸尾,Tth DNA聚合酶：在高温和MnCl2存在的条件下，能有效地逆转录RNA。用于一步法RT-PCR。Vent DNA聚合酶：又称Tli DNA聚合酶，该酶耐高温且具有3-5外切酶活性的校对功能，其保真性较Taq DNA聚合酶高一倍。该
10、酶扩增长片断（12kb）的功能较强。Pfu DNA聚合酶 ：具有35外切酶活性的校对功能，催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍，但不适于2kb的片断扩增。,2）其他的耐热聚合酶,（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系
11、中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数主要取决于模板DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加,二、PCR的衍生技术,逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）反向PCR（inverse PCR）巢氏PCR（nesting PCR） 原位PCR（in situ PC
12、R） 多重PCR（multiplex PCR）多重等位基因PCR（multiplex allele PCR） 不对称PCR（asymmertric PCR）锚定PCR（anchored PCR）长片段PCR（long fragment PCR）荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）,逆转录酶,DNA聚合酶活性,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,1、逆转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR),影响因素,（1）模板对RT-PCR的影响对RNA制品的纯度和完整性要求都极为严格 （2）逆转录酶对RT-PCR的影响ML
13、V逆转录酶能合成大于2kb的较长cDNA，但对热的稳定性较AMV逆转录酶差。（3）逆转录引物对RT-PCR的影响随机引物：原核细胞多用oligo(dT)：真核细胞多用基因特异性的引物（GSP）：特异性强，广谱性低,例子： S.pn的转化对PsaA基因mRNA表达的影响,a、RNA的提取：野生型和转化缺陷型S.pn都诱导转化后，采用Qiagen试剂盒进行总RNA提取。 b、cDNA的制备： 取RNA 2l，随机引物1l，DEPC水9l，混匀后，70变性5min，立即置于冰上。然后顺序加入逆转录buffer 5l，dNTP 1.5l, RNasin 0.5l, DEPC水5l, 逆转录酶M-MLV
14、 1l。混匀后于37，1小时，得到cDNA。 c、PCR扩增: PsaA的引物3L，cDNA 1L，Tag plus酶0.2L，共30L体系。循环参数：94 30秒，55 40秒，72 45秒，循环30次。用16s rRNA的PCR产物为标准物，2%琼脂糖电泳。,电泳结果用软件Quantity-one 3.2进行半定量比较，结果进行配对t检验分析,16S(463bp) PsaA(254bp),图2， 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA mRNA的表达。,1 2 3 4 5 6 7,图1， 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA 的RT-PCR电泳图。 l
15、ine1: Marker2. line2-4: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2 was added CSP. line5-7: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2d was added CSP.,*,*,*,2、反向PCR (inverse PCR),用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 应用： （1）用于测序的DNA大片段的克隆 （2）获得启动子序列 （3）小质粒的定点突变 （4）鉴定插入失活基因或体内诱导基因,已知序列,未知序列,未知序列,
16、限制酶,限制酶,连接酶,反向PCR示意图,转化到大肠杆菌后，提取质粒，采用质粒引物即可直接对X片断进行扩增后测序，得到X基因序列信息。（10/64）,例子： S.pn体内诱导基因序列的获得,3、多重PCR(multiplex PCR),用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,图1 第1、2、3组引物多重PCR电泳图 1：正常对照；2：DL2000 marker；310：检出的缺失型患者,杜氏/贝克型肌营养不良症,一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最常见，约占55%65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点,4、突变PCR,（1）随机突变：
17、 应用：构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特殊性质的突变个体 策略：易错PCR（error-prone PCR）。 利用Taq DNA聚合酶等耐热DNA聚合酶不具有35校对功能的特性，在PCR扩增反应中可能掺入错误的核苷酸，从而产生随机错误的扩增产物。 加入次黄嘌呤核苷酸并限制某一种核苷酸的用量，从而促进DNA聚合酶选择其它3种核苷酸或次黄嘌呤核苷酸，导致扩增产物发生突变。,（2）定点突变,（1）5端引入突变：通过修饰上游引物的5 端，即可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。（2）序列中的单位点突变：采用重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE PCR),（
18、A）为5端引入突变 （B）为单碱基突变,例子：S.pn的ply146aa缺失的突变序列构建,S.Pn的ply为一细胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗：首先设计4个引物：（M1和M2完全重叠） P1: 5-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH I P2: 5-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3 Xho I M1: 5-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3 M2: 5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3,以基因组DNA 为模板，以P1和M1为
19、引物扩增出ply上游片断，以P2和M2为引物扩增出ply下游片断 以上下游片断为模板，以P1和P2为引物，扩出全长 酶切后克隆到质粒中保存,（3）多位点突变,策略：多次重叠PCR 关键：重叠引物的设计（每对突变引物需要部分重叠，方向相反）。,5、原位PCR (In Situ PCR),原位PCR是由Hasse等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。,操作步骤 1. 细胞
20、或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物,A.阳性对照,B.阴性对照,C.原位检测mRNA表达,三、实时荧光PCR技术,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程； 结合相应的软 件可以对结果 进行分析，计 算待测样品的 初始模板量。,如何定量？,Ct值的概念 Ct值的定义：PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。 为什么要用Ct值定量 实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检
21、测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。,C(t)值的重现性,相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；C(t)值具重现性,C(t)与初始模板含量,初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系,定量原理,初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值） Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,确定初始模板的浓度,1、荧光定量PCR标记方法内掺式染料SYBR Green I序列特异性探针Taqman Molecular Bea
22、consDual Probes(FRET)引物特异性探针 Amplifluor (Intergen),SYBR-Green I,1）内掺式染料,SYBR-Green I,优点,使用方便- 不必设计复杂的引物 没有序列特异性- 可以用于不同的模板 便宜 灵敏,例子：荧光定量PCR检测肺炎链球菌comE基因转录水平,方法流程： 1、标准品制备：普通PCR扩增出comE基因片断装入克隆质粒定量稀释为109拷贝作为标准品备用 2、定量检测comE基因表达水平：提取RNA逆转录成cDNA与成10倍梯度稀释的标准品一起作为模板，同时进行荧光定量PCR根据实验数据分析结果得到其表达的绝对量。,图1 comE
23、基因荧光定量PCR扩增曲线,图2 comE基因荧光定量PCR融解曲线,表1 D39菌株在CSP诱导后不同时间的comE基因mRNA表达,*：p0.05，CSP诱导10min时comE的表达量较0min和20min时显著增高,实验结果：,Oligo 1: Fluorescein,Oligo 2: LC Red 640,荧光共振能量传递（FRET Probe）,2）序列特异性探针,双标记探针（Taqman Probe）,优点,对目标序列有很高的特异性-特别适合于SNP检测 与 Molecular Beacons 相比设计相对简单 是目前应用最广泛的一种技术,SNP检测,X,分子信标（Molecul
24、ar Beacon Probe）,引物特异性探针（Amplifluor Probe）,3）引物特异性探针,2、荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 灵敏度高灵敏的荧光检测较电泳检测灵敏度高 特异性高使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 定量准确全程监控，准确的算法进行定量 无需跑胶，自动化程度高,4通道实时荧光定量PCR仪,3、荧光定量 PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。,PCR只是一个简单的不起眼玩艺凯利穆利斯（Kary Mullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作
25、的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 它最大的特点就是能不断推出新形式。 摘自Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow,PCR技术的应用,研究与生产 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，肿瘤诊断 法医 犯罪现场标本分析 其他,1) 基因克隆,重组质粒,酶切,PCR扩增,染色体DNA,连接,基因工程产品,我国已批准生产的部分生物技术药物 名 称 作 用 rhu EPO 产生红细胞 rhu IFN1b (外用) 病毒性角膜炎 rhu IFN1b 乙肝、丙肝 rhu IFN2a 乙肝、丙肝
26、、疱疹等 rhu IFN2a (酵母) 乙肝、丙肝 rhu IFN2b 乙肝、丙肝白血病等 rhu IFN2a (栓剂) 妇科病 rhu IFN2b (凝胶剂) 疱疹等 rhu IFN 类风湿 人胰岛素 糖尿病 rhu GCSF 刺激产生白细胞 rhu GMCSF 刺激产生白细胞、骨髓移植rhu GH 矮小病 乙肝疫苗 预防乙肝 rhu EGF(外用) 烧伤、创伤 EGF 衍生物 烧伤、创伤 rhu IL2 癌症辅助治疗 rhu IL2 125Ser 癌症辅助治疗 bFGF(外用) 创伤、烧伤 RSK 溶血栓(心梗) 抗IL28 单 抗乳膏剂 银屑病 痢疾疫苗 预防痢疾,Sequencing
27、by synthesis (Illumina/Solexa)：read length 80-150bp, 1G/run.,2)基因测序,PCR,PCR,3)基因检测,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,外源性基因,正常人 (-),病 人 (+),-地中海贫血症,扩增阻滞突变系统（ amplification refractory mutation system，ARMS）进行检测,（1）内源性基因检测遗传病的诊断,300bp,1000bp,800bp,图1，珠蛋白ARMS检测结果1 1、2分别为正常样本的N产物和M产物，3、5、7为检测样本的N产物, 4、6、8为相应M产物。,图2，珠蛋白
28、ARMS检测结果21为N产物，2为M产物,对照产物861bp,囊性纤维化病(CF),镰刀型细胞贫血症,（2）外源性基因检测病原体的诊断,丙型肝炎病毒（HCV）感染的诊断,HBV感染的传统诊断主要采用免疫测定法检测血清标本中的HBSAg，HbeAg，抗-Hbs，抗-HBc和抗-Hbe（两对半），免疫学方法虽然比较简单，但只能提供血清中的HBV间接证据，无法证明是否具有传染性，且敏感性较低。目前的荧光定量PCR方法多采用TaqMan探针，一般根据HBV基因中的高度保守序列来设计，能够检测少至10拷贝/mL的HBV DNA。检测限范围宽为2502.5109拷贝/mL，是传统方法的良好补充。,乙型肝炎
29、病毒（HBV）的PCR检测,普遍认为HBeAg阳性者具有较强的传染性，而HBeAb的出现说明病情好转或稳定，其传染性弱。这113例HBeAg阴性患者检出42例HBV-DNA阳性，阳性率37.2%，具有传染性。,A组(HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均阳性)，B组(HBsAg、抗-HBc均阳性)，C组（抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc均阳性），D组（抗-HBc 阳性）， E组（抗-HBe、抗HBc阳性）,表1 不同模式HBeAg阴性乙肝患者HBV-DNA阳性率（%）,采用聚乙二醇干扰素-2a（PEG-IFN）、拉米夫定（LAM）、阿德福韦（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替比夫定（LDT）和替
30、诺福韦（TDF）治疗1年。 上图为HBeAg阳性慢性乙肝患者，下图为HBeAg阴性慢性乙肝患者。,目前结核病确诊主要依靠痰片染色，抗酸杆菌和结核杆菌的培养法鉴定。但涂片阳性率不高，且不能确诊；培养法需较长时间。 ELISA和RIA法敏感性低，尚不能直接检测临床标本。,结核分枝杆菌感染的分子诊断,北京胸科医院、北京市结核病胸部肿瘤研究所、上海肺科医院三家医院的考核情况。医院 结核组351例 对照组160例 例数 涂阳 培阳 北京胸科 143 36 42 60 北京结研所 151 40 31 50 上海肺科 57 57 29 50,结核分枝杆菌(TB) FQ-PCR检测与常规检测比较,FQ-PCR
31、法与涂片法、培养法的检出率比较,组别 涂片法 培养法 FQ-PCR法 例数 阳性 检出率 阳性 检出率 阳性 检出率 结核病组 351 133 37.9% 102 29.1% 220 62.7%对照组 160 0 0% 0 0 % 0 0 %,4)基因配型,5）法医学分析,女性,男性,Y引物,PCR,男性 女性,个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLPDNA遗传指纹PCR-ASOPCR-VNTR多态性PCR-SSCP线粒体DNA测序,DNA 指纹图谱鉴定,返,思考题,一次特异性很好的PCR后，所得产物的长度都是一样的吗？ PCR技术的核心思路是什么，还可以有哪些变化，以实现不同的研究目的？,
