1、菌落总数一、菌落总数介绍：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37培养 48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，
2、菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的 10 倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出 1mL 置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为 48 小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每 ml）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作一般包括：样品的稀释倾注平皿培养 48 小时
3、计数报告。国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。检验方法参见：GB4789.2-94 中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定SN0168-92 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品菌落计数三、说明（一）样品的处理和稀释：1操作方法：以无菌操作取检样 25g（或 25ml)，放于 225mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充
4、分振要或研磨制成 1：10 的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以 800010000r/min 的速度处理 1min，制成 1：10 的均匀稀释液。用 1ml 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成 1：100 的稀释液。另取 1ml 灭菌吸管，按上项操作顺序，制 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用 1 支 1ml 灭菌吸管。2无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装
5、，应用 75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露 15 分钟，每个平板不得超过 15 个菌落。3采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。4样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。为减少稀释误差，SN 标准采用取 10mL 稀释液，注入 90mL 缓冲液中。5稀释液：样品稀
6、释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。（二）倾注培养1操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择 23 个适宜稀释度，分别在制 10 倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取 1ml 稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至 46营养琼脂培养基注入平皿约 15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有 1ml 稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置 361温箱内培养 482h，取出计算平板内菌落数目，乘以
7、稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。2倾注用培养基应在 46水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一，从 1220ml 不等，一般以 15ml 较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。3为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过 20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。4培养温度一般为 37（水产品的培养温度，由于其生活
8、环境水温较低，故多采用 30）。培养时间一般为 48h，有些方法只要求 24h 的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养 48h 后，培养基失重不应超过 15。5为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于 4环境中放置，以便计数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。（三）计数和报告1操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各
9、平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每 ml）中的菌落数，进行报告。2到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过 24h。3计数时应选取菌落数在 30300 之间的平板（SN 标准要求为 25250 个菌落），若有二个稀释度均在 30300 之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于 2 取平均数，比值大于 2 则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。4若所有稀释度均不在计数区间。如均大于 300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于 30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于
10、300，有的又小于 30，但均不在 30300 之间，则应以最接近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于 1 乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。5不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。6当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均
11、应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘 2 代表全平板的菌落数。7当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于 300 时），但分布很均匀，可取平板的一半或 1/4 计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。8菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在 1100 时，按实有数字报告，如大于 100 时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm 2）报告。 大肠菌群及检验 一、大
12、肠菌群介绍大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在 37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大
13、肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关
14、的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在 37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。（一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。361培养 482h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，361培养18-24h，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管 361培养
15、 242h，观察产气情况。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查 MPN 表，报告每 100ml（g）大肠菌群的 MPN 值。具体操作参见 GB4789.3-94 中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定（二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国 FDA 的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管 LST 肉汤。361培养 482h，观察是否产气。证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，361培养 482h，观察是否产气。以 BGLB 产气为阳性。查 MPN 表，报告每
16、ml(g)样品中大肠菌群的 MPN 值。具体操作参见 SN0169-92 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法三、说明：1MPN 检索表：MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN 检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加 10 倍。注意国家标准和行业标准中所附 MPN 表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。2初发酵和证实试验：无论是国家标准的
17、三步法还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在 37分解乳糖产酸产气”。初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。3产气量与倒管：在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产
18、酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。4挑选菌落：国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌
19、落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。5抑菌剂：大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中 LST 肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB 肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。沙门氏菌及检验 人沙门氏菌病有四类
20、综合症：沙门氏菌病；伤寒；非伤寒型沙门氏菌败血症和无症状带菌者。沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，通常表现为轻度，持久性腹泻。伤寒实际上是由伤寒沙门氏菌所致。未接受过治疗的病人致死率可超过 10%，而对经过适当医疗的病人其致死率低于 1%，幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。这些无症状携带者不显示发病症状仍能将微生物传染给其他人(传统的例子就是玛丽伤寒)。非伤寒型沙门氏菌败血症可由各型沙门氏菌感染所致，能影响所有器官，有时还引起死亡。幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。一、致病性沙门氏菌胃肠炎，潜伏期一般 6-72 小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤
21、头痛。病程一般 1-2 天或更长。感染剂量为 15-20 个菌，死亡率达 1-4%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的粪便，沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中，包括生肉，禽，奶制品和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰子，酱油和沙拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力。沙门氏菌属也是嗜温性细菌，在中等温度，中性 pH，低盐和高水活度条件下生长最佳。生长最低水活度为 0.94。兼性厌氧，对中等加热敏感。同样
22、，该菌属能适应酸性环境。通过卫生以防止二次污染；蒸煮；巴氏消毒等控制。正常家庭烹调，个人卫生可以防止煮熟食品的二次污染，以及控制时间和温度一般都能充分防止沙门氏菌病的发生。二、检验因沙门氏菌是最常见的食源性细菌病原体，因此在本节中重点介绍沙门氏菌的检验。沙门氏菌是食物传播病原菌中研究最活跃的细菌。从食品中分离和鉴定沙门氏菌，当前通用的方法学分 5 个步骤：1.前增菌-第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。2.选择性增菌-在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖
23、。3.选择性平板分离-这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。4.生物化学筛选-排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。这五个步骤代表理想状况。不过一个有经验的检验员，可能在一个或几个步骤中看出特性和差别。目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础，25g 食品为标准分析单位。三、从食品中分离沙门氏菌样品的制备下面的方法是以 25g 样品为检测单位，样品：肉汤为 19 的比例。除非另有说明，根据混合程度，加足够的肉汤保持 19 的比例。对不需准确称量检测的样品，例如：田鸡腿，可参看
24、特定方法说明。1、干蛋黄、干蛋白、干全蛋、液奶（去脂牛奶，含 2%脂肪牛奶，全脂奶，和脱脂奶）、粉状调制食品（蛋糕，甜饼，炸面圈，饼干和面包）、婴儿食品、口食或软管进食含蛋的食品：检验前的冷冻样品最好不要解冻。如果冷冻样品必须软化以获取待检测部分，则尽可能迅速的解冻所需部分，使竞争菌数少增加或降低沙门氏菌的可能损伤。解冻需在 45以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行 15min或在 25，18 小时内解冻。无菌操作称取 25g 样品，放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。非粉状的样品，加入 225mL 灭菌乳糖肉汤。如果制品是粉状，加入约 15mL 灭菌乳糖肉汤，
25、用灭菌玻璃棒，匙或灭菌压舌器搅拌，使成均匀悬液。再加 3 份乳糖肉汤 10mL，10mL，190mL，使总量为 225mL。充分搅拌，直到样品完全悬浮没有团块为止。盖紧瓶盖在室温静置60min。振摇使充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时用灭菌的 1NNaOH 或 1NHcl调节 pH 至 6.80.2。在测定最终 pH 前要盖紧瓶盖并充分混匀。然后将瓶盖旋松约 1/4 圈，置 35培养 242 小时。以下步骤按四，1-10 进行。2、蛋类：A、含壳蛋：用硬刷子在水流下刷洗蛋。把蛋在含 0.1%十二烷酸磺酸钠（SDS）的 200ppm 氯离子溶液中浸泡 30min。加 8mL 5.25%次氯酸
26、钠到含 1g SDS 的 992mL 蒸馏水中，制备 200ppm cl-/0.1%SDS 溶液。这种消毒剂需在使用前临时制备。无菌操作打开蛋，使用灭菌的蛋分离器，弃去蛋白。无菌操作称取 25g 蛋黄到灭菌的 500mL 锥型瓶或其他合适容器内。加 225mL 胰胳胨（胰化物）大豆肉汤（TSB），并振荡充分混匀。在室温下静置 60 分钟。振摇使其充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH 值至 6.80.2，置 35培养 242小时，以下步骤按四，1-10 继续。B、液全蛋（均状）：无菌操作称 25g 置于无菌的 500mL 锥形烧瓶或其它合适容器中。加 225mLTSB 并振荡充分混匀
27、。按上面所述继续。C、煮硬的蛋（鸡蛋，鸭蛋或其他蛋类）：目前，不知道蛋白中的沙门氏菌抑制因子是否具有热稳定性。因此，无菌操作分离蛋白和蛋黄。称取 25g 粉状蛋黄固体到无菌 500mL 锥型瓶或其他合适容器中。加 225mLTSB 并旋转充分混匀。按上面所述继续。3、脱脂乳粉A、速溶：无菌操作称取 25g 样品，加入灭菌烧杯（250mL）或其它合适容器内。经灭菌玻璃或纸质（用带卷好以备高压灭菌）漏斗，往灭菌的 500mL 锥形烧瓶或其它合适容器中（装有 225mL 煌绿水），缓缓倾注 25g 检测单位，使其覆盖在煌绿水表面。也可将多份 25g 检验单位按比例 倒入相应份数的煌绿水表面。按每 1
28、000mL 灭菌蒸馏水中加 1%煌绿溶液 2mL 配置煌绿水。将盛有样品前增菌培养基的容器静置 605 分钟。松松地盖上容器盖，不需要混合或调节 pH 值，于 35培养 242 小时，以下步骤按四，1-10 继续。B、非速溶：按上述 A 脱脂乳粉的方法进行，只不过不允许将多份检验单位按比例合并检验。4、全脂奶粉：无菌操作称取 25g 样品，加入无菌的，带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。加入 225mL 灭菌蒸馏水并振荡充分混匀。盖紧在室温下静置60 分钟。使其充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH 值至 6.80.2。在测定最终 pH 前要盖紧瓶盖并充分混匀。然后加
29、 0.45mL1%的煌绿染液并充分混匀。旋松瓶盖约 1/4 转后，置 35培养 242 小时，以下步骤按四，1-10 继续。5、酪蛋白：无菌操作称取 25g 样品，加入无菌均质杯中，加 225mL 灭菌乳糖肉汤到样品中并匀质 2 分钟。无菌操作，把已匀质的混合物转移到灭菌，带螺旋帽的500mL 广口瓶或其他合适的容器内。盖紧盖子在室温下静置 60 分钟。振摇使充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH 值至 6.80.2。在测定最终 pH 前要盖紧瓶盖并充分混匀。旋松瓶盖约 1/4 圈后，置 35培养 242 小时，以下步骤按四，1-10 继续。6、大豆粉：无菌操作称取 25g 样品，加
30、入灭菌烧杯（250mL）或其它合适容器内。用灭菌玻璃或纸质（用带卷好以备高压灭菌）漏斗，往装有 225mL 乳糖肉汤的灭菌的 500mL 锥形烧瓶或其它合适容器中，缓缓倾注 25g 检测单位，使其覆盖在乳糖肉汤表面。检测单位（25g）不可多份按比例混合检测。容器静置 605 分钟。松松地盖上容器盖，不需要混合或调节 pH 值，于 35培养 242 小时，以下步骤按四，1-10 继续。7、含蛋制品（面条，蛋卷，通心粉，意大利面条）、干酪、生面团、调制色拉（火腿，蛋，鸡肉，金枪鱼，火鸡）、新鲜的、冷冻的、或干的水果和蔬菜、果仁、甲壳类动物（小虾，蟹，小龙虾，LANGOSTINOS，龙虾）和鱼：检测
31、前冷冻样品最好不要解冻，如果冷冻样品必须软化以取其检测部分，则要在持续搅拌并带有自动调温器控制的 45水浴内 15 分钟内解冻。或者在2518 小时内进行。无菌操作称取 25g 样品，加入灭菌的均质器中。加入 225mL 灭菌的乳糖肉汤并均质 2 分钟。再无菌操作转移已均质的混合物到无菌的带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。盖紧瓶盖，于在室温下静置 60 分钟。振摇使其充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH 值至 6.80.2。充分混匀。旋松瓶盖约 1/4 转后，置 35培养 242 小时，以下步骤按四，1-10 继续。8、干酵母：无菌操作称取 25g 样品，放入灭菌
32、带螺旋帽的广口瓶中（500mL），或其他合适的容器内。加入 225mL 灭菌胰酪胨（胰化）大豆肉汤，充分混匀使酵母形成均匀悬液。盖紧瓶盖于在室温下静置 60 分钟。振摇使其充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时，调节 pH 值至 6.80.2，在测定最终 pH 前要混合充分。旋松瓶盖约 1/4 转后，置 35培养 242 小时。非活性干酵母，以下步骤按D，1-11 进行。活性干酵母，混匀经培养过的样品，转种 1mL 到 10mL 月桂基蛋白（LST）中，另转种 1mL 到 10mL 四磺酸盐（TT）肉汤中。将此两种选择性肉汤于 35培养 242 小时。充分地旋转混合经培养过的增菌肉汤，每种肉汤
33、都要用 3mm 接种环划线接种 3 个选择性平板（四，3 和四，4），接下面的四，510 进行。9、食品上霜和上顶用的混合物：无菌操作称取 25g 样品，放入灭菌，带螺旋帽的广口瓶或其他合适的容器中。加入 225mL 营养肉汤并充分混合。盖紧瓶盖在室温下静置 60 分钟。振摇使其充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时，调节 pH 值至 6.80.2。旋松瓶盖约1/4 转后，置 35培养 242 小时。以下步骤按四，1-10 继续。10、调味品：A、黑胡椒、白胡椒、芹菜籽或者干辣椒粉、小茴香、红辣椒、欧芹片、迷迷香、芝麻、麝香草、蔬菜片：无菌操作称取 25g 样品，放入灭菌带螺旋帽的广口瓶或其他
34、合适的容器中。加入 225mL 灭菌胰酪胨大豆（TSB）肉汤，充分混匀，盖紧瓶盖于在室温下静置 60 分钟。旋动混匀，用试纸测定 pH 值。必要时，调节 pH 值至 6.80.2。旋松瓶盖约 1/4 转后，置 35培养 242 小时。以下步骤按四，1-10 继续。B、洋葱片、洋葱粉、大蒜片：无菌操作称取 25g 样品，放入灭菌带螺旋帽的广口瓶或其他合适的容器中。将样品于含 K2SO3的 TSB 胰酪胨大豆肉汤（1000mLTSB 加 5g K2SO3使 K2SO3的最终的浓度为 0.5%）中进行前增菌。添加K2SO3于肉汤中。分装 225mL 于 500mL 锥形瓶中，经 121高压灭菌 15
35、 分钟。灭菌后无菌操作测定容量，必要时再调整至 225mL。将 225mL 含 K2SO3的无菌 TSB加入样品中，充分混匀。接下去按三，10A 节进行。C、牙买加胡椒、桂皮、丁香及薄荷：目前还没有方法可以中和这四种香料的毒性。将香料稀释至无毒的程度，再进行菌检。检验牙买加胡椒，桂皮和薄荷时，样品与肉汤比例为 1100，而丁麝香样品与肉汤比例为 11000。检查叶状的调味品，因遇到脱水的制品，可吸收肉汤这一实际困难，其样品与肉汤比例要大于 110。检查这些调味品按三，10A 描述的方法进行，保持推荐的样品与肉汤的比例。11、糖果与糖衣（包括巧克力）：无菌操作称取 25g 样品放入灭菌的搅拌容器
36、中。加入 225mL 灭菌的调配脱脂乳粉，搅拌 2 分钟。再无菌操作转移搅拌过的混合物到灭菌带螺旋帽的500mL 广口瓶中或其他合适的容器内。盖紧瓶盖在室温下静置 60 分钟。转动混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH 值至 6.80.2。再加入 0.45mL1%煌绿染液混匀，将瓶盖旋松 1/4 转后培养。以下按四，110 节进行。12、椰子：无菌操作称取 25g 样品放入灭菌的带螺旋帽的 500mL 广口瓶中或其他合适的容器内。加入 225mL 灭菌的乳糖肉汤，振摇后，盖紧瓶盖在室温下静置 60 分钟，再振摇使其充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH 值至 6.80.2。总计
37、加入 2.25mL 已蒸过（15 分钟）的阴离子特吉托尔 7 号，并充分混匀。可用已蒸过（15 分钟）的三硝基甲苯 X100 来代替。这些表面活性剂限制使用最小量，使之刚刚起泡沫即可。三硝基甲苯 X100 大约 2 或 3 滴。旋松瓶盖约 1/4 转后，置 35培养 242 小时。以下步骤按四，1-10 继续。13、食用染料与食用色素：pH6.0 或以上的染料（10%悬浮液），按上述干全蛋方法（C1）处理。沉淀染料或 pH 低于 6.0 的染料，无菌操作称取 25g 样品，放入灭菌的带螺旋帽的500mL 广口瓶中或其他合适的容器内。加入 225mL 不含煌绿染料的四硫磺酸盐肉汤混匀。盖紧瓶盖在
38、室温下静置 60 分钟，用 pH 计调节 pH 值至 6.80.2。再加入 2.25mL0.1%的煌绿溶液，充分旋动混匀。旋松瓶盖约 1/4 转后，置 35培养 242 小时。接下去按下面的四，310 节进行。14、明胶：无菌操作称取 25g 样品，放入灭菌的带螺旋帽的 500mL 广口瓶中或其他合适的容器内。加入 225mL 灭菌的乳糖肉汤和 5mL5%明胶酶水溶液。混合均匀，盖紧瓶盖在室温下静置 60 分钟。转动混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH值至 6.80.2。将瓶盖旋松 1/4 转，置 35培养 242 小时。以下按四，110 节进行。15、肉、肉代用品、肉副产品、动物产品
39、、腺体制品和粗粉（鱼，肉，骨）：无菌操作称取 25g 样品放入灭菌的搅拌器中。加入 225mL 灭菌的乳糖肉汤，搅拌 2 分钟。再无菌操作转移已搅拌的混合物到灭菌的带螺旋帽的 500mL 广口瓶中或其他合适的容器内。盖紧瓶盖在室温下静置 60 分钟。如果混合物为粉状，研磨过或已粉碎的，则不用搅拌。不需要搅拌的样品，加入乳糖肉汤，并充分混匀；盖紧瓶盖在室温下静置 60 分钟。旋动使充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH 值至 6.80.2。总计加入 2.25mL 已蒸过（15 分钟）的特吉托尔阴离子 7 号，混匀。也可用已蒸过（15 分钟）的三硝基甲苯 X100 来代替。控制使用这些表
40、面活性剂剂量，刚刚起泡沫即可。实际用量取决于试验材料的成分；分析粉状腺体制品，不需要用表面活性剂。将瓶盖旋松 1/4 转后，将样品混合物置 35培养 242 小时。以下按四，110 节进行。16、田鸡腿（此方法用于国内的和国外的所有田鸡腿检验）：将 15 对田鸡腿放入灭菌塑料袋内，并用灭菌乳糖肉汤浸没。如果单个腿估计平均重在 25g 或以上，则只需检查 15 对的每对中的一条腿。把袋放入大塑料烧杯内或其它合适的容器中，在机械荡器上震荡 15min，以 4cm（1-1/2in）机械振荡 100 次/分钟。从袋中倾倒出乳糖肉汤于另一个灭菌塑料袋内。加更多的乳糖肉汤，使总量为 3500mL。充分混匀
41、，于室温下静置 60 分钟。必要时调节pH 值至 6.80.2。再把装有乳糖肉汤的塑料袋放入塑料烧杯或其它合适的容器内，于 35培养 242 小时。接下去按下面的四，110 节进行。17、野兔骨架（此方法用于国内的和国外的所有的野兔骨架）：取 3 只野兔骨架放入灭菌塑料袋内，并用灭菌乳糖肉汤浸没（见上述A，2325 节），把袋放入大塑料烧杯内或其它合适的容器中，在机械震荡器上以 4cm（1-1/2in）幅度振荡 100 次/分钟，震荡 15min。从袋中倾倒出乳糖肉汤混合物于另一个灭菌塑料袋内，加更多的乳糖肉汤，使总量为 3500mL。充分混匀，于室温静置 60 分钟。必要时用 pH 试纸调置
42、 6.80.2，于 35培养242 小时。接下去按下面的四，110 节进行。18、口香糖：无菌操作称取 25g 样品到灭菌烧杯（250mL）或其他合适容器中。制备过滤除菌的 1.0%纤维素酶溶液（加 1g 纤维素酶到 99mL 无菌水中），用 0.45um 膜过滤除菌，置于 150mL 瓶中。（纤维素酶溶液在 2-5可保存最长 2 周时间）。加入 225mL 无菌乳糖肉汤和 2.25mL 无菌 1%纤维素酶溶液于 500mL 无菌带螺旋盖的广口瓶或其他合适容器。用磁力搅拌器剧烈搅拌酶/肉汤混合物时，通过无菌玻璃漏斗迅速倒入 25g 待检样品。旋好瓶盖，室温下静置 60 分钟，无须调pH 值。旋
43、松瓶盖，35培养 242 小时。以下按四进行。四、沙门氏菌的分离1、拧紧瓶盖并轻轻振荡培养过的样品混合物。生鲜食物、严重污染的食品和动物饲料：转移 0.1mL 混合物到 10mLRAPPAPORTVASSILIADIS（RV）肉汤培养基中，另转移 1mL 混合物到 10mL 四硫磺酸盐肉汤（TT）中。其它食品：转移 1mL 混合物到 10mL 亚硒酸盐胱氨酸肉汤（SC）中，另转移 1mL 混合物到 10mL 四硫磺酸盐肉汤（TT）中。2、选择性增菌按如下步骤进行：生鲜食品、严重污染的食品和动物饲料：RV 培养基在 420.2（水溶）中培养 242 小时。TT 肉汤在 430.2（水溶）中培养
44、242 小时。其它食品：SC 和 TT 肉汤在 35培养 242 小时。3、混合均匀（如果是试管，涡旋式混合），用 3mm 直径的接种环，满环（10l）划线接种 TT 肉汤于亚硫酸铋（BS）琼脂，木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂和 HEKTOEN 氏肠道菌（HE）琼脂平板上。BS 琼脂平板于划线接种的前一天制备好储存在室温暗处。4、再用 3mm 直径的接种环， 从 RV 培养基（样品为生鲜食物，严重污染的食品和动物饲料）和 SC 肉汤（除了生鲜食物，严重污染的食品和动物饲料以外其它样品）取满环（10l），划线接种于上述平板上。5、把选择性平板置 35培养 242 小时。6、检查平板中可疑沙门
45、氏菌菌落的存在。典型的沙门氏菌菌落形态：从每个经过 242 小时培养后选择性平板上挑 取 2 个或更多个菌落。典型的沙门氏菌菌落如下：A、在 HEKTOEN 氏肠道菌（HE）琼脂上。菌落呈兰绿至兰色，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的光泽黑色中心或几乎全部黑色的菌落。B、在木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂上。粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可有大的光泽黑色中心或呈几乎全部黑色的菌落。C、亚硫酸铋（BS）琼脂上。呈褐色，灰色或黑色，有时带有金属光泽。菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有所谓的晕环效应。如果典型菌落出现在经 242 小时培
46、养后的 BS 琼脂上，则挑取 2 个或更多个典型菌落。不论 BS 琼脂平板在培养 242 小时时是否挑取过菌落，BS 平板再培养 242 小时。培养了 482 小时后，如果 BS 平板上出现典型菌，则挑取2 个或更多个菌落，如果只在经过 242 小时培养的 BS 平板上挑取了菌落，接种到三糖铁琼脂（TSI）和赖氨酸琼脂（LIA）上，会呈现非典型反应以至视为培养物中不存在沙门氏菌 。参见下面四.8 部分和四.9 部分，有关 TSI 和 LIA反应的详细描述。非典型的沙门氏菌菌落形态：不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。A、HE 和 XLD 琼脂：非典型的沙门氏
47、菌在 HE 和 XLD 琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。HE和 XLD 平板经 242 小时培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取 2 个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。B、BS 琼脂：某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果 BS 平板培养 242 小时后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养 242 小时。如果经 482 小时培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现，则挑取 2 个或更多个非典型的菌落。7、用灭菌接种针轻轻地接触每个菌落中心部位，接种 TSI 斜面，先在斜面上划线，再于底层穿刺。不需灼烧接种针，即可接种 LIA 斜面，先穿刺接种底层两次，再划线
48、斜面上。由于赖氨酸脱羧反应需严格厌氧条件，因而 LIA 斜面必须有深的底层（4cm）。将已挑过菌落的选择性平板于 58储存。8、将 TSI 和 LIA 琼脂斜面于 35分别培养 242 小时。当进行斜面培养时放松试管帽以保持需氧条件，以防止过量的 H2S 产生。在 TSI 琼脂中，典型的沙门氏菌培养物使斜面呈碱性（红色），底层呈酸性（黄色），产生或不产生 H2S（琼脂变黑色）。在 LIA 琼脂中，典型的沙门氏菌培养物其试管底层呈碱性（紫色）反应。只有试管底层呈明显黄色时才认为有酸性（阴性）反应。不要单纯根据其试管底层产生的褪色反应就排除它。在LIA 中，大多数沙门氏菌培养物皆产生 H2S；一些
49、非沙门氏菌培养物产生砖红色反应。9、在 LIA 琼脂上所有底层呈碱性反应的培养物，无论其在 TSI 琼脂上反应如何，皆应全部保留为可疑的沙门氏菌分离物，并进一步做生化和血清学试验。在 LIA 中呈酸性底层反应和在 TSI 中呈斜面碱性，底层酸性的培养物，均视为可疑的沙门氏菌分离物，应进一步做生化和血清学试验。在 LIA 中呈酸性底层和在 TSI 中呈酸性斜面和酸性底层的培养物，可视为非沙门氏菌培养物而弃去。对所保留的拟定阳性 TIS 琼脂培养物，可按下面四，10 节叙述的进行检测，是否为沙门氏菌，包括亚利桑那沙门氏菌。如果 TSI 中培养物没有呈现沙门氏菌的典型反应（斜面碱性，底层酸性），再从未拟定阳性的选择性平板上另外挑取可疑菌落，象上面四，7 节所述的接种 TSI 和 LIA 斜面。10、生化和血清学鉴定试验：a 从亚硒酸盐胱氨酸肉汤（或相应食品的 RV 培养基）划线分离的选择性琼脂平板上所挑取的 3 个拟定阳性 TSI 琼脂培养物和从四硫磺酸盐肉汤划
