1、微生物检验方法,第五小组,一、总则二、菌落总数三、粪大肠菌群四、霉菌和酵母菌,一、总则,1.范围 本规范规定了化妆品微生物学检验的基本要求。 本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。2.仪器和设备 天平 高压灭菌器 振荡器 三角瓶(250mL) 玻璃珠 玻璃棒 刻度吸管 (1 mL、10mL) 研钵或均质器恒 温水浴箱,生理盐水(成分：氯化钠 8.5g) 蒸馏水加至1000mL,溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90mL，103.43kPa（121 15 lb）20min高压灭菌。 SCDLP 液体培养基 成分：酪蛋白胨 17g 大豆蛋白胨 3g 氯化钠 5g 磷酸氢二钾 2.5
2、g 葡萄糖 2.5g 卵磷脂 1g 吐温80 7g 蒸馏水 1000mL 制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调pH为7.27.3 分装，103.43kPa（121 15 lb）20min 高压灭菌。注意振荡，使沉淀于底层的吐温80 充分混合，冷却至25左右使用。 注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。 灭菌液体石蜡。灭菌吐温80。,3.培养基和试剂,所采集的样品，应具有代表性。 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品
3、做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散， 所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。,4 样品的采集及注意事项,液体样品 水溶性的液体样品，可量取10mL 加到90mL 灭菌生理盐水中，如样品少于10mL，仍按10 倍稀释法进行。如为5mL 则加到45mL 灭菌生理盐水，混匀后，制成1：10 检液。 油性液体样品，取样品10mL，先加5mL 灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80，在4044水浴中
4、振荡混合10min，加入灭菌的生理盐水75mL（在4044水浴中预温），在4044水浴中乳化，制成1：10 的悬液。,5 供检样品的制备,膏、霜、乳剂半固体状样品 亲水性的样品：称取10g，加到装有玻璃珠及90mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15min。用其上清液作为1:10 的检液。 疏水性样品：称取10g，放到灭菌的研钵中，加10mL 灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加入10mL 灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70mL 灭菌生理盐水，在4044水浴中充分混合，制成1：10 检液。,固体样品称取10g，加到90mL 灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为
5、1：10 的检液。如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g 样品加入90mL灭菌生理盐水，均质1min2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g 样品，加10mL灭菌液体石蜡，10mL 吐温80，70mL 灭菌生理盐水，均质3min5min。,二、菌落总数,1 范围 本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法。 本规范适用于化妆品菌落总数的测定。,2 定义菌落总数（Aerobic bacterial count）是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH 值、需氧性质等），1g（1mL）检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生
6、长的嗜中温的需氧性菌落总数。测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。,3 仪器和设备三角瓶，250mL。量筒，200mL。pH 计或精密pH 试纸。 高压灭菌器。 试管：15150mm。 灭菌平皿：直径9cm。 灭菌刻度吸管，10mL、1mL。 酒精灯。 恒温培养箱：361。 放大镜。,生理盐水卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基成分：蛋白胨 20g、牛肉膏 3g 、氯化钠 5g 、琼脂 15g、卵磷脂1g、 吐温80 7g、 蒸馏水 1000mL制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分（除琼脂外）加到其余的蒸馏水中，溶解。加入已溶解
7、的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH 值为7.17.4，加入琼脂，103.43kPa（121 15 lb）20min 高压灭菌，储存于冷暗处备用。0.5氯化三苯四氮唑 成分：TTC 0.5g 蒸馏水 100mL溶解后过滤，103.43kPa（121 15 lb）20min 高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4冰箱备用。,4 培养基和试剂,(1) 用灭菌吸管吸取1：10 稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL 注入到9mL 灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成1：100 检液。吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。如样品含菌量高
8、，还可再稀释成1：1000 1:10000，等，每种稀释度应换1 支吸管。,(2) 将融化并冷至4550的卵磷脂吐温80 营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约 15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置361培养箱内培养48h2h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL 卵磷脂吐温80 营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置361培养箱内培养48h2h，为空白对照。,5 操作步骤,(3) 为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL 卵磷脂吐温80 营养琼脂中加入1mL 0.5的TTC 溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变
9、化。,6 菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大 5 倍10 倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。,(1)首先选取平均菌落数在30 个300 个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表1 中例1）。,(4)若所有稀释度的平均菌落数均小于30 个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告
10、之（见表1 例5）。,7 菌落计数及报告方法,(5)若所有稀释度的平均菌落数均不在30 个300 个之间，其中一个稀释度大于300 个，而相邻的另一稀释度小于30 个时，则以接近30 或300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1 中例6）。,(3)若所有稀释度的平均菌落数均大于300 个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释,(2) 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30 个300 个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2 则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数（见表1 中例2 及例3）。,(6)若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g 或每mL 小于
11、10CFU。 菌落计数的报告，菌落数在10 以内时，按实有数值报告之，大于100 时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10 的指数来表示（见表1 报告方式栏）。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。,三、粪大肠菌群,1 范围 本规范规定了化妆品中粪大肠菌群的检验方法。 本规范适用于化妆品中粪大肠菌群的检验。 2 定义 粪大肠菌群系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.50.5培养24h48h 能发酵乳糖产酸并产气。 该菌直接来自粪便，是重要的卫生指示菌。灭菌平皿：直径90mm。,3 仪器 恒温水浴箱或隔水式恒温箱
12、：440.5。 温度计 显微镜 载玻片接种环 电磁炉 三角瓶，250mL 试管：15150mm 小倒管 pH 计或pH 试纸高压灭菌器。灭菌吸管，10mL、1mL灭菌平皿：直径90mm,4 培养基和试剂双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基 成分：蛋白胨 40g 猪胆盐 10g 乳糖 10g 0.4溴甲酚紫水溶液 5mL 卵磷脂 2g 吐温80 14g 蒸馏水 1000mL 制法：将卵磷脂、吐温80 溶解到少量蒸馏水中。将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中，加到一起混匀，调pH 到7.4，加入0.4溴甲酚紫水溶液，混匀，分装试管（每支试管中加一个小倒管）。68.95kPa（115 10 lb）20
13、min 灭菌。,伊红美兰（EMB）琼脂 成分：蛋白胨 10g、乳糖 10g、磷酸氢二钾 2g、琼脂 20g、 2伊红水溶液 20mL、0.5美蓝水溶液 13mL、蒸馏水 1000mL 蛋白胨水（作靛基质试验用） 成分：蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g、氯化钠 5g、蒸馏水 1000mL,双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基 成分：蛋白胨 40g 猪胆盐 10g 乳糖 10g 0.4溴甲酚紫水溶液 5mL 卵磷脂 2g 吐温80 14g 蒸馏水 1000mL,4 培养基和试剂,革兰氏碘液 成分：碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水加至 300mL,革兰氏染色液,靛基质试剂,成分：结晶紫染色液：结晶紫 1g 95
14、乙醇 20mL 1草酸铵水溶液 80mL,脱色液：95乙醇。 复染液： （1）沙黄复染液：沙黄 0.25g、95乙醇 10mL、蒸馏水 90mL （2）稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95乙醇100mL，放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL，加5石碳酸水溶液90mL 混合，即为石碳酸复红液。再取此液10mL加水90mL，即为稀石碳酸复红液。,染色法 （1）将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。 （2）滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。 (3)滴加95乙醇脱色，约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。 (4)滴加复染液，复染
15、1min，水洗，待干，镜检。 (5)染色结果 革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 注：如用1:10 稀释石碳酸复红染色液作复染，复染时间仅需10s。,(1) 取10mL 1：10 稀释的检液，加到10mL 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置440.5培养箱中培养24h48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。 (2 )如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置361培养18h24h。同时取该培养液12 滴接种到蛋白胨水中，440.5培养24h2h。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常
16、具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。 (3) 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。 (4 )在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。,6 检验结果报告 根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。,5 操作步骤,四、霉菌和酵母菌,1 范围 本规范规定了化妆品中霉菌和酵母菌数的检测方法。 本规范适用于各种化妆品中霉菌和酵母菌的计数。 2 定义 霉菌和酵母菌数测定是指化妆品检样在一定
17、条件下培养后，1g 或1mL 化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。 本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置282培养72h，计算所生长的霉菌和酵母菌数。,培养箱：282。振荡器。 天平。三角瓶，250mL。试管：15150mm。平皿：直径9cm。 吸管，1mL、10mL。量筒，200mL。酒精灯。 高压灭菌器。,3 仪器和设备,生理盐水 虎红（孟加拉红）培养基 制法：将上述各成分（除虎红外）加入蒸馏水中溶解后，再加入虎红溶液。分装后，103.43kPa（121 15 lb）20min 高压灭菌，另用少量乙醇溶解氯霉
18、素，过滤溶解后加入培养基中，若无氯霉素，使用时每1000mL 加链霉素30mg。,4 培养基和试剂,(1)样品稀释,(2)取1：10、1：100、1：1000 的检液各1mL 分别注入灭菌平皿内，每个稀释度各用2个平皿，注入融化并冷至451左右的虎红培养基，充分摇匀。凝固后，翻转平板，置281培养72h2h，计数平板内生长的霉菌和酵母菌数。若有霉菌蔓延生长，为避免影响其它霉菌和酵母菌的计数时，于48h2h 应及时将此平板取出计数,(4)每g（或每mL）化妆品含霉菌和酵母菌数以CFU/g（mL）表示。,(3)计算方法：先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，求出每个稀释度的平均菌落数。判定结果时，应选取菌落数在5 个50 个范围之内的平皿计数，乘以稀释倍数后，即为每g（或每mL）检样中所含的霉菌和酵母菌数。其它范围内的菌落数报告应参照菌落总数的报告方法报告之。,5 操作步骤,谢谢观赏,
