1、伊利液态奶事业部微生物检验方法1目 录一、微生 物检验 标准 二、总则三、微生物 检验操作指导1菌落总数 测定2大肠菌 群测定3嗜冷菌/ 低温 菌测定4芽孢及 耐热芽孢总数 测定5霉 菌和酵母 菌计数6商业 无菌7消毒洁净度 及膜类微生物检测8空气微 生物检测9大肠杆菌的测定修订： 徐冬梅、张彩霞 审核：孙秀芝审批： 李印所 日期： 2006 年 2月 17日 伊利液态奶事业部微生物检验方法2一、微生物检验标准 S序号检验项目 方 法 名 称 检 验 标 准 名 称 检 验 标 准 号 备 注平板计数法 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定 GB/T 4789.2 1 菌落总数仪器法 设备说明书
2、 / 微生物快速检测仪发酵法 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定 GB/T 4789.3 2 大肠菌群 快速检测（MPN 法、平板法）食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测 GB/T 4789.32-20023 嗜冷菌 平板计数法牛奶中嗜冷菌的测定 IDF 101A：1991 /4芽孢、耐热芽孢 平板计数法伊利集团内部技术资料 乳与乳制品微生物检验方法 芽孢和耐热芽孢的测定YLNB 3.6 /5霉菌、酵母菌计数 平板计数法 食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母计数 GB/T4789.15 /6 商业无菌 /食品卫生微生物学检验 罐头食品商业无菌检验 GB/T4789.26 /7消毒洁净度及膜类微
3、生物检测微生物涂抹法 食（饮）具消毒卫生标准 GB 14934 包括膜、包材涂抹8空气微生物检测 自然沉降法公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定 GB/T18204.1平皿放置时间 15分钟9 大肠杆菌葡萄糖苷酶荧光方法出口食品中大肠杆菌检验方法 SN 0333-94 /注：所引用标准未注明年号的执行最新有效版本伊利液态奶事业部微生物检验方法3二、总 则 S执行 GB/T 4789.1食品卫生微生物学检验 总则 、GB/T4789.28食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 。（一）样品的采集1. 样品的采集必须遵循无菌操作程序。抽样工具如整套不锈钢勺子、镊子、剪刀等应当灭菌；容器须灭菌
4、，且清洁、干燥、防漏、广口、大小适合盛放检样。2. 抽样全过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。3. 确定检验批，应注意产品的均质性和来源，确保检样的代表性。4. 成品检样，对包装完整的样品进行采集；已开包的坏包样品须及时转移至无菌容器中，再进行微生物检测 。5.常见的抽样方法有5.1直接食用的小包装食品尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。5.2桶装或大容器包装的液体食品5.2.1抽样前摇动或用灭菌棒搅拌液体，尽量使其达到均质；抽样时应先将抽样用具浸入液体内略加漂洗，然后再取所需量的样品；装入灭菌盛样容器的量，不应超过其容量的四分之三，以便于检验前将样
5、品摇匀。5.2.2如为非冷藏易腐食品，应迅速将所抽样品冷却至 0-4。5.3桶装或大容器包装的固体食品5.3.1每份样品应用灭菌抽样器由几个不同部位采取，一起放入一个灭菌容器内。5.3.2注意不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。5.4生产过程中的抽样5.5.1划分检验批次，应注意同批产品质量的均一性。5.5.2如用固定在贮液桶或流水作业线上的抽样龙头抽样时，应事先将龙头消毒。(二)样品的标记、保存和运送抽样过程中应对所抽样品进行及时、准确的标记；抽样结束后，应由抽样人写出完整的抽样记录，使样品尽可能保持在原有条件下迅速发送到实验室。伊利液态奶事业部微生物检验方法41.样品的标记1.1
6、所有盛样容器必须有和样品一致的标记。在标记上应标明到货批次、采样日期、品名或编号、采样地点，以及其他需要说明的情况。标记应牢固，具防水性，字迹不会被擦掉或脱色。1.2当样品需要托运或由非专职抽样人员运送时，必须标识样品容器。2.样品的保存和运送2.1抽样结束后应尽快将样品送往实验室检验。如不能及时运送，需冷却和易腐食品存放在 0-4冰箱或冷却库内；其他食品可放在常温冷暗处。2.2运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。必要时可于途中补加冷却剂或冷冻剂。2.3如不能由专人携带送样时，也可托运。托运前必须将样品包装好，应能防破损，防冻结或防易腐和冷冻样品
7、升温或融化。在包装上应注明“防碎” 、 “易腐” 、 “冷藏”等字样。2.4作好样品运送记录，写明运送条件、日期、到达地点及其他需要说明的情况，并由运送人签字。(三).检验微生物检验室接到样品，应立即登记，并按检验要求，立即将样品放在冰箱或适合贮存区域，积极准备条件进行检验。原料奶、配料或半成品奶，采样后应立即于 4下冷藏，尽快检测。伊利液态奶事业部微生物检验方法5三、微生物检验操作指导 S（一）.菌落总数的测定方法一：平板法1.其他要求1.1营养琼脂培养基：按 GB/T4789.28 中规定或将购买制好的营养琼脂按说明制备、分装（不超过容积的 3/4）于 300ml三角瓶中，高压灭菌 （12
8、1、20 分钟） 。1.2微生物实验用的各种加塞容器，如试管、稀释液瓶、培养基瓶、培养液管等，在高压灭菌前需加塞后再用双层报纸或牛皮纸包扎封口处，以防二次污染。1.3实验过程打开过灭菌桶盖或包扎纸的剩余接种器材（如吸管、试管、平皿） ，不得留做下次使用，需重新灭菌后再使用。1.4实验过程打开过包扎纸的剩余培养基（如琼脂培养基等） ，不得重新灭菌或留做下次再使用（建议将剩余营养琼脂倾倒成平板，备用） 。1.5稀释使用的 9ml稀释液，用灭菌后三角瓶中的稀释液，使用时分装于试管中。1.6制备 225ml稀释液时，建议使用 300ml的锥形瓶进行盛放，以便稀释后混匀充分。1.7培养基准备：使用接受检
9、查预先灭菌过的营养琼脂培养基是否处于正常、可用状态。1.8环境监测1.8.1超净台内环境的监测：每批实验时需要对照监测方法：在无菌操作的条件下，取一个灭菌平皿倾入 15mL营养琼脂培养基，待凝固后，在超净台中打开盖，暴露从操作开始至操作结束的整个过程（皿盖斜搭在皿底侧边上，以不遮盖皿底琼脂为宜） ，结束后合上盖，做好标记后进行同条件培养，作为超净台环境对照样。1.8.2接种室和培养室或缓冲间环境的监测：每周至少监测 1次。方法：见空气微生物检测 ，其采样点数为 2个/区域/次。2、操作注意事项2.1紫外线灭菌前，用新洁尔灭消毒液擦拭超净台台面、无菌室桌面等；无菌室须设专用盆、抹布（纱布） 。伊
10、利液态奶事业部微生物检验方法62.2操作前，先使用新洁尔灭消毒液清洗操作员手部、抹布,再用酒精棉球手局部消毒。2.3超净台风机需打开，前挡风玻璃需拉下；鼓风水平风向，无前挡风玻璃时，建议戴口罩。2.4取检样要具有代表性，固体样品要多取几个部位，液体样品要充分混匀。2.5在酒精灯火焰周围 4-5cm区域内操作。建议吸管接样前转动通过火焰灭菌，接样后不过火焰；吸头接吸管前要在火焰周围挤捏排气2.6样品、容器打开前需使用酒精棉从开口端向周围方向擦拭消毒。2.7打开或加完样后塞上容器时，瓶口（或管口） 、瓶塞（或管塞）建议通过火焰灭菌。2.8液体样品加入时要沿壁流入，吸管尖端不得触及稀释液或培养液。2
11、.9使用后的样品、器材要及时撤出超净台。2.10同时持两支试管时，管口、塞子互相不得接触。2.11选择的稀释度要适当（使菌落数在 30-300之间） 。 2.12检样稀释后，应尽快接种，倾倒培养基。一般从检样稀释开始到倾到培养基，应在 15min内操作完毕。2.13为了排除实验试剂的干扰，操作同时，用 1ml灭菌吸管吸取 1ml生理盐水于一个灭菌平皿中，然后将营养琼脂分别注入上述加有 1ml灭菌生理盐水的平皿和另一个灭菌的空平皿内，做好标记后进行同条件培养，作为稀释液和培养基的空白对照。2.14 注意抑菌现象，如检样中含有一定量的抑菌剂，可产生低稀释度的平板上菌落少、高稀释度的平板上菌落反而增
12、多的现象。3、培养注意事项3.1培养箱应保持一定的湿度，培养基平板培养 48h后，培养基失重不应超过15%。3.2定期用消毒剂擦拭培养箱箱内金属孔架及内壁（须切断电源后擦拭） 。3.3必要时需延长培养时间（72 小时或更长些） ，以利于微生物生长、观察。4.菌落计数及报告注意事项伊利液态奶事业部微生物检验方法74.1 如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，有两种可能性：一是检验工作中发生差错；二是受抑菌剂影响。这二种情况均不可用作检样计数报告的依据。4.2 如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在培养基与检样混合时，一个细胞块被分散所造成，此时一条链作为一个菌落
13、计，如有来源不同的几条链，每条链应作为一个菌落计。4.3 如果所有平板上都菌落密布（因稀释度选择不当造成，而不是因污染造成此情况） ，不要用多不可计报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中 2个 lcm2面积的菌落数，取其平均值后求出 lcm2内平均菌落数，乘以皿底面积 63.6cm2（9cm皿） ，再乘以其稀释倍数，以此结果作报告。例如：10 -110 -3稀释度的所有平板上均菌落密布，而在 10-3稀释度的平板上任意数 2个 lcm2面积内的菌落数是 60个，皿底直径为 9cm，则该检样每克（或 ml）中“估计”菌落数为：60263.610001.910 6 cfu/g（ml）4.4每个
14、平板上的菌落数均需记录于原始记录中，如平行样、稀释度、各项空白实验等。环境监测、试剂空白对照及样品原倍样液培养后未长菌时，结果均以“无菌落生长”进行报告。方法二：仪器法（仅适用于生鲜牛乳）1.仪器设备BactoScan FC型微生物检测仪、微生物采样小瓶2.方法（具体见 FC微生物快速检测仪操作规程 ）取牛乳样放于吸管下，设定检测样品为 NORMAL，并输入样品数据，按“STORE”键，再按 MEASURE键进行测定，待屏幕出现检测结果时，即可读数。（二）.大肠菌群的测定 S概念： 群：两个不同种的微生物之间经常会出现一些介于这两种之间的中间类型的菌种。例如：大肠杆菌与产气肠细菌两种菌种之间的
15、区分是十分明显的，但另外还有一些菌种介于这两种菌种之间的中间类型，就是说，他们在亲缘关系上是比较接近的一些菌种。在分类上，就是大肠杆菌，产气肠细菌和一些中间型的菌种合归为一群，伊利液态奶事业部微生物检验方法8就是大肠菌群。大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以 100ml(g)检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。MPN为最可能数的简称，表示样品中活菌的密度，是用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN 检索表只给出了三个稀释度，如
16、果改用不同的稀释度，则表内数值应相应降低或增加 10倍。方法一：发酵法1.其他要求1.1培养基可按 GB/T4789.28 中规定或购买制好的培养基，按说明配制；伊红美蓝琼脂培养基，要求分装（不超过容积的 3/4）于 300ml三角瓶中。1.2其它同菌落总数测定中相应要求。2、操作注意事项2.1初发酵（其目的在于检查样品中有无发酵产生气体的细菌） 2.1.1 同时取不加任何样液的单、双料培养管各 1支做好标记后进行同条件培养，作为培养液的空白对照。2.1.2 试验表明，大肠菌群的产气量与大肠菌群的检出率呈正相关系。但也随样品的种类而变。大肠菌群的产气量多者可充满整个倒气管，少者可产生比小米粒还
17、小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵管有疑问，可用手轻轻打动试管,如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。另外，产气量与倒气管有一定的关系，倒气管口不完整，有利于气体的进入；管口周围有沉淀等物质能影响气体的进入。2.1.3乳糖发酵试验系样品的发酵，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性并不代表大肠菌群阳性，因此，必须作进一步证实试验。2.2分离培养（平板分离的目的在于检查乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内，有无需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌存在） 2.2.1 接种环使用前灭菌要彻底，灭菌后待稍冷却接种。2.2.2划线后要形成单个菌落伊利液态奶事业部微生物检验方法92.2
18、.3同时取 1个灭菌的空平皿，注入 15ml伊红美蓝琼脂培养基，做好标记后进行同条件培养，作为培养基的空白对照。大肠菌群细菌能分解乳糖产酸，使伊红和美兰结合而成黑色物，故菌落呈紫黑色（大肠杆菌）或褐色（产气克雷伯氏菌等） ，前者有时还产生有金属光泽。2.3证实试验 （复发酵实验，检验的目的在于证明从乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体） 2.3.1挑选菌落在平板呈现紫黑色，有或无金属光泽，检出率最高；粉红色、粉色检出率低。另外，只挑选一个菌落影响大肠菌群的检出率，当菌落不典型时，应挑取 23个菌落作证实试验，以免出现假阴性。2.3.2同时取 1支复
19、发酵管做好标记后进行同条件培养，作为培养液的空白对照。2.4抑菌剂大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。胆盐的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法添加。2.5指示剂溴甲酚紫属于酸碱指示剂，其 pH变色范围为：黄 5.26.8紫，当料管中培养基（pH=7.40.1）的颜色由紫色变为黄色时，证明培养基中有酸性物质产生，此时培养基的 pH5.2，培养基呈酸性。2.6用于初发酵试验或复发酵试验的小导管内应无气泡，有气泡时就不能使用，接种之后，要用同批未
20、接种的发酵管置于温箱内，同时培养，作为空白。2.7 检查初发酵试验的乳糖胆盐管内是否有乳糖分解菌存在时，应以产气为主，产酸仅作参考。因为培养基中所用的指示剂为溴甲酚紫，其有效 PH 为 5.2-6.8，变色点为 6.0，如果产酸未能达到使下降至 6.0 以下时，变色就不显著。2.8 检查发酵管中小导管内气泡时，即使只有微量气泡出现，亦应判定为阳性。有时小导管的管口被样品颗粒封住，气体未能进入导管，如加以振摇，管底有小气泡上升，亦应视为阳性。3、结果报告注意事项伊利液态奶事业部微生物检验方法103.1各项空白对照实验的结果均需记录于原始记录中。3.2如空白对照管培养后无产酸、产气时，结果报告阴性
21、即可。3.3大肠菌群三步法的结果均需记录于原始记录中，记录方式统一为：3.3.1初发酵为阳性时，用“+”表示；3.3.2分离培养为一、二或三类菌落，分别用 “、”在右下角表示；3.3.3革兰氏染色为阴性或阳性时，分别用“-、+” ，球菌、杆菌分别用“c、b” 在右上角表示；3.3.4复发酵为阳性时，在初发酵的“+”上加一圆圈表示。例如：+ Ib- 表示初发酵为阳性，分离培养为一类菌，革兰氏染色为阴性杆菌，复发酵为阳性。方法二：大肠菌群的快速检测（GB/T4789.32-2002）1术语：大肠菌群是革兰氏阴性、无芽孢、氧化酶阴性的杆状细菌，为需氧和兼性厌氧，可在有胆盐（或具有其他抑制生长的表面活
22、性剂）存在的情况下生长，通常可在 362下发酵乳糖并产酸和醛。具有 -半乳糖苷酶。在本方法设定的条件下，大肠菌群为能分解 -半乳糖苷、使培养基发出荧光或生成紫色（或红色）菌落的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。2原理2.1最可能数（MPN）法大肠菌群可产生 -半乳糖苷酶，分解液体培养基中的酶底物-4-甲基伞形酮-半乳糖苷（以下简称，MUGaL）,使 4-甲基伞形酮游离，因而在波长 366nm的紫外灯照射下呈现蓝色荧光。2.2平板法大肠菌群可产生 -半乳糖苷酶，分解液体培养基中的酶底物-茜素-半乳糖苷（以下简称 ALiz-gal）,使茜素游离并与固体培养基中的铝、钾、铁、铵离子结合形成紫色（或红色）的螯
23、合物，使菌落呈现相应的颜色。3 试剂和培养基3.1磷酸盐缓冲液按 GB4789.28-1994中 3.22规定制备。3.2生理盐水伊利液态奶事业部微生物检验方法113.3 MUGaL肉汤3.3.1成分胰蛋白胨或胰酪胨 20.0g氯化钠 5.0g无水磷酸氢二钾 2.75g无水磷酸二氢钾 2.75g月桂基硫酸钠 0.1gMUGaL（纯度不低于 99%） 0.08g蒸馏水 1000ml3.3.2制法将各成分加热溶于蒸馏水中，以 15%-20%氢氧化钠溶液调整 pH值，分装于试管，每管 9ml，116蒸汽灭菌 10分钟，最终 pH值 7.0-7.2。待培养基冷却后，以无菌操作于每管培养基内加入 0.1
24、ml经无菌水稀释的 500g/ml 头孢磺碇液或于 300ml灭菌培养液内加 0.3ml经无菌水稀释的 5mg/ml头孢磺碇液并以无菌操作分装试管。注：双料 MUGaL肉汤除蒸馏水外，其他成分加倍。也可直接购买 MUGaL肉汤培养基，按要求制备。3.4 ALiz-gal琼脂3.4.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨 20.0g氯化钠 5.0g无水磷酸氢二钾 2.75g无水磷酸二氢钾 2.75g月桂基硫酸钠 0.1gALiz-gal（纯度不低于 97%） 0.05g异丙基硫代半乳糖苷 0.03g硫酸铝钾 0.5g柠檬酸铁铵 0.5g琼脂 15.0g蒸馏水 1000ml伊利液态奶事业部微生物检验方法123.
25、4.2 制法将各成分加热溶于蒸馏水中，以 15%-20%氢氧化钠溶液调整 pH值，分装烧瓶，116蒸汽灭菌 10分钟，最终 pH值 7.0-7.2。也可直接购买 ALiz-gal琼脂培养基，按要求制备。4 设备和器材4.1培养箱：（371）4.2冷藏箱：（04） 4.3天平：感量 0.01g4.4均质器或乳钵4.5平皿：直径 90mm4.6试管：20mm200mm、18mm180mm4.7吸管：1.0ml 和 10.0ml4.8广口瓶或三角瓶：4.9玻璃珠：直径约 5mm4.10试管架4.11紫外灯（波长 366nm） ，功率6W5检验程序检样稀释MUGaL肉汤（MPN 法）371 18h24
26、h有荧光 无荧光ALiz-gal琼脂（平板法）371 18h24h计数紫色（或红色）菌落在波长 366nm紫外灯下置暗处观察伊利液态奶事业部微生物检验方法136 样品的制备6.1 以无菌操作取检样 25ml（或 25g）样品，加于含 225ml无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）的三角瓶内（必要时瓶内预置适当数量的玻璃珠） ，充分振摇或用均质器以 8000r/min10000r/min的速度均质 1min，做成 1：10 的稀释液。6.2用 1ml灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1.0ml，注入含有 9.0ml无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）的试管内，振摇均匀，做成 1：100 的稀释液。6.3 另取
27、 1.0ml 灭菌吸管，按上法制备 10倍递增样品稀释液。每递增稀释一次，换用一支 1.0ml灭菌吸管。6.4根据食品卫生标准要求或对检样污染程度的估计，选择三个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种三管培养基（MPN 法）或两个平皿（平板法）7 大肠菌群的 MPN计数7.1将待检样品和样品稀释液 MUGaL肉汤管，每管 1.0ml(接种量在 1.0ml以上者，接种双料 MUGaL肉汤管)。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种三管培养基。同时另取 2支 MUGaL肉汤管（或双料 MUGaL肉汤管）加入与样品稀释液等量的上述无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）作空白对照。7.2 接种后的培养管置于 3
28、71培养箱培养 18h-24h。7.3 将培养管置于暗处，用波长 366nm的紫外光灯照射，如显蓝色荧光，为大肠菌群阳性管；如未显蓝色荧光，则为大肠菌群阴性管。7.4结果报告：根据大肠菌群阳性管数，查 MPN表，报告每 100ml(g)食品中大肠菌群 MPN值。8 大肠菌群的菌落计数8.1 用灭菌吸管吸取待检样液 1.0ml，加入无菌平皿内。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种两个平皿。8.2 于每个加样平皿内倾注 15ml46的 ALiz-gal琼脂，迅速轻轻转动平皿，混合大肠菌群阳性报告大肠菌群阴性报告 报告伊利液态奶事业部微生物检验方法14均匀。待琼脂凝固后，再倾注 3ml-5ml
29、ALiz-gal琼脂覆盖表面。同时将 lALiz-gal琼脂倾入加有 1ml上述无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）的无菌平皿内作空白对照。8.3 待琼脂凝固后，翻转平板，于 371培养箱培养 18h-24h。取出平板，计数紫色（或红色）菌落。8.4结果报告8.4.1 当平板上的紫色（或红色）菌落数不高于 150个，且其中至少有一个平板紫色（或红色）菌落不少于 15个时，按下式计算大肠菌群数：cN = （n 1+n2）d式中：N-样品中的大肠菌群数，个/ml 或 g；c-所有计数平板上，紫色（或红色）菌落数之总和；n1- 供计数的最低稀释倍数的平板数；n2-供计数的高一个稀释倍数的平板数；d-供计数
30、的样品最低稀释度（如 101 ，10 2 ，10 3 等） 。8.4.2 如接种所有（3 个）稀释样品的平板上，紫色（或红色）菌落数均少于 15个时，仍按上式计算，但应在所得结果旁加“*”号，表示为估计值。8.4.3如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，紫色（或红色）菌落数均少于15个时，报告结果为：每毫升（克）样品少于 15个大肠菌群。8.4.4如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，均未发现紫色（或红色）菌落时，报告结果为：每毫升（克）样品少于 1个大肠菌群。8.4.5如平板上的紫色（或红色）菌落数高于 150个时，按上式计算，在结果旁加“*”号，表示为估计值或视情况重新选择较高的稀释倍
31、数进行测定。（三）.嗜冷菌总数的测定 S方法一：基准法6.5，培养 10天（仲裁法）1.设备和材料伊利液态奶事业部微生物检验方法151.1低温生化培养箱：（6.50.5）1.2微生物实验室常用仪器，制备和稀释样品所用仪器2.培养基和试剂2.1配制 1000ml平板计数琼脂的营养琼脂加 1g脱脂奶粉 （如 23.5g+脱脂奶粉 1g） ，溶于 1000ml水中，必要时用滤纸过滤，调节 pH值为 6.90.1；将培养基分装于三角瓶中，121、15min 高压灭菌。注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。2.2生理盐水： 8.5g氯化钠溶于 1000ml蒸馏水中，分装后高压灭菌（121、20min） 。3.
32、操作步骤同菌落总数测定中要求。4.培养温度及时间置于（6.50.5）的生化培养箱内培养 10天，取出计数。注：每叠皿不应超过 6个，每叠皿之间以及与培养箱的壁之间应保持一定的间隙。5. 菌落计数方法对平皿进行菌落计数时，应在柔和的光线下计数。为了便于计数，可使用适当的放大镜和（或）菌落计数器。以防极小的菌落遗漏，以及避免将平皿中杂质颗粒进行计数。仔细检查可疑的物质，如需要可使用更高倍数的放大镜，以区别菌落和外来物质。6. 菌落计数的报告6.1 平板菌落数的选择平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀
33、，即可计算半个平板后乘 2以代表全皿菌落数。平板内若有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限） ，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。6.2 稀释度的选择及报告6.2.1 选取菌落数在 10-300之间的培养皿作为计数的测定标准。6.2.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数在 10-300之间，则按下面的方法计数。计算每 ml牛奶中微生物的个数 N，用以下的公式：c伊利液态奶事业部微生物检验方法16N = （n 1+0.1n2）d这里c： 是所有皿上菌落数的总和n1： 是第一个稀释度培养皿的个数n2： 是第二个稀释度培养皿的个数d： 是与第一个稀释液相对
34、应的稀释因子结果保留两位有效数字。结果以科学计数法表示。举例微生物计数给出以下的结果（包括两个带盖培养皿）：在第一个稀释度（10E-2）：168和215个菌落在第二个稀释度（10E-3）：14和25个菌落c 168+215+14+25 422N = = = =19182（n 1+0.1n2）d 2+（0.1*2）*10 -2 0.022根据上面所说结果进行取舍为19000，结果为1.910 4个/ml。注：如果有两个以上可以计数的稀释度，公式应修改为用多个稀释度进行计算。如为三个稀释度，由下面的公式可计算出每毫升中微生物的数量。cN = （n 1+0.1n2+0.01n3）d6.2.3 如果菌
35、落数均小于 10，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数，报告每毫升牛奶菌落的估计数。6.2.4 如果菌落数均超过 300，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数，报告每毫升牛奶菌落的估计数。7.其它同菌落总数测定中相应要求。方法二：快速法21，培养 251 范围本标准描述的是通过 21时快速菌落计数技术进行嗜冷菌菌数估算的方法。此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验当需要很快的得到嗜冷菌估算值的时候。2 方法提要2.1 准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿。伊利液态奶事业部微生物检验方法172.2 将培养皿在 21条件下培养 25h。2.3 根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的
36、菌落数，选择菌落数比较恰当的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数。3设备和材料培养箱：（211）其它同方法一4. 操作步骤同方法一5培养温度及时间待培养基凝固翻转平板，放入 21培养箱内培养 25h。6菌落计数方法同方法一 7菌落计数的报告同方法一（四）. 芽孢、耐热芽孢的测定 S1、概述将少量原奶（5-10ml）在 80和 100下分别加热 10min，在不同温度下培养计数。2、设备和材料2.1 培养箱：（3035 ）、 （5055 ）各 1 台2.2 恒温水浴：(461) 2.3 平皿：直径 90mm2.4 试管2.5 吸管2.6 广口瓶或三角烧瓶2.7 试管架2.8 恒温水浴：80和 1
37、00各 1 个2.9 温度计：(0100)伊利液态奶事业部微生物检验方法183、培养基和试剂3.1 生理盐水3.2 营养琼脂或锰盐琼脂4、操作步骤4.1 芽孢总数的测定4.1.1 样品的前处理4.1.1.1 以无菌操作将 5-10ml 原奶样品加入一具塞灭菌试管内，在另一试管加入与奶等量的水，并在加水的试管中插入一支温度计。4.1.1.2 将两支试管同时放入 80的恒温水浴中，待温度升至 80后，保温 10min。4.1.2 样品的稀释及培养4.1.2.1 保温结束后，将含原奶的试管用冷水迅速冷却。4.1.2.2 根据样品的污染程度，选择 2 个适当的稀释度，分别做 10 倍递增稀释的同时，即
38、以吸取该稀释度的吸管移 1ml 稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做 2 个平皿。4.1.2.3 稀释液移入平皿后，即使将凉至 46的培养基注入平皿内，使其混合均匀。同时做空白对照实验。4.1.2.4 待琼脂凝固后，翻转平板，置(30-35)培养箱下培养 72h。4.1.2.3.菌落计数方法参见菌落总数的计数方法。4.1.2.4 菌落数的报告参见菌落总数的报告方式。4.2 耐热芽孢总数的测定4.2.1样品的前处理4.2.1.1以无菌操作将 5-10ml原奶样品加入一具塞灭菌试管中，在另一试管加入与奶等量的水，并在加水的试管中插入一根温度计。4.2.1.2将两支试管同时放入 100的恒温水浴中，待温
39、度升至 100后，保温10min。如果水达不到 100就沸腾，则等待时间需延长。或在水中加入盐以提高沸点温度，但要避免原奶样品沸腾。4.2.2样品的稀释及培养伊利液态奶事业部微生物检验方法194.2.2.1保温结束后，将含原奶的试管用冷水迅速冷却。4.2.2.2根据样品的污染程度，选择 2个适当的稀释度，分别做 10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移 1ml稀释液与灭菌平皿内，每个稀释度做 4个平皿，分成 2组，每组 2个平皿。4.2.2.3稀释液移入平皿后，即将凉至 46的培养基注入平皿内，使其混合均匀。同时做空白对照实验。4.2.2.4待琼脂凝固后，翻转平板，将 1组平皿置于(30
40、-35)培养箱，另一组放入(50-55)培养箱内，均培养 72h。4.2.3菌落计数方法参见菌落总数的计数方法。4.2.4菌落数的报告参见菌落总数的报告方式。在(30-35)条件下培养的菌落数为耐热适中温菌的芽孢数，而在(50-55)条件下培养的菌落数为耐热嗜热型的芽孢数。计数两个温度下的总和为每毫升测试样品中的总耐热芽孢总数。（五）霉菌和酵母菌计数 S1、培养基：按 GB/T4789.28规定制备或购买制好的培养基，按说明分装（不超过容积的 3/4）于 300ml三角瓶中，高压灭菌 121、20 分钟。2、有条件的实验室应单设霉菌、酵母菌检测无菌室；应避免打开长有霉菌的培养皿，高压灭菌后再处
41、理、清洗。3、其它同菌落总数测定中相应要求（六）. 商业无菌 S 要求：须严格按 GB/T4789.26 食品卫生微生物学检验 罐头食品商业无菌检验中6检验步骤进行，并填写产品商业无菌检验报告 ；商业无菌检验报告中至少须体现以下信息：1核验生产操作记录，包括自动记录、手工记录 ，是否符合商业无菌相关 CCP点要求，具体为：11 无菌系统的灭菌记录（超高温、无菌罐、灌装机、 ）12 生产时超高温、无菌罐、灌装机运行记录13 产品密封性检查结果伊利液态奶事业部微生物检验方法202抽样是否符合相关规定3保温试验结果 31 感官（包装外观、标识等，产品色泽、组织状态、煮沸时组织状态、气味、滋味品尝等）
42、32 理化：净含量、理化指标4微生物细菌检测结果（每批产品检测保温 3-5天样品） ；如有微生物检出，则须进行微生物是否增殖的验证试验5每项核验、检验人员及报告复核人签字（七） 消毒洁净度及膜类微生物检测（涂抹方法） S 1.材料1.1三角烧瓶：150ml1.2 75%酒精棉球1.3镊子1.4涂抹纸：面积 5cm5cm，约 10张置于平皿中，用报纸或牛皮纸包扎1.5平皿：直径为 9cm2.试剂2.1生理盐水：8.5g 氯化钠溶于 1000ml蒸馏水中，以 50ml量分装于 150ml三角瓶中。2.2高压灭菌：将备好的生理盐水、涂抹纸在 121下高压灭菌 20分钟。3.操作步骤3.1以无菌操作向
43、高压灭菌后的装有涂抹纸的平皿中倒入少量生理盐水，润湿即可。3.2涂抹前，用酒精棉球将手和镊子擦拭三次，进行彻底消毒。3.3涂抹时，用无菌镊子取润湿涂抹纸 2张，平铺在被检测物品的表面（有效面积50 cm2）约 30秒，然后将此涂抹纸置于盛有 50ml灭菌盐水的三角瓶中，充分振荡20次，制成原液。不能及时检测，应暂时置于冰箱中，于 4小时内检测。3.4检测步骤菌落总数：同前相应检测方法大肠菌群：同前相应检测方法；其中接 3 管双料伊利液态奶事业部微生物检验方法213.5报告：菌落总数报告为 cfu/cm2，大肠菌群报告为 MPN/100 cm2。（八）空气微生物检测 S1.设备和材料1.1生化培
44、养箱：（361） OC1.2天平1.3恒温水浴锅：（461） OC1.4平皿：直径为 9cm1.5菌落计数器1.6酒精灯1.7三角瓶，容量为 300ml1.8记号笔2.培养基营养琼脂培养基：按 GB/T4789.28中规定或将购买制好的营养琼脂按说明制备，分装于 300ml三角瓶中，高压灭菌 （121、20 分钟） 。3、方法3.1在无菌条件下，将凉至 46的营养琼脂注入灭菌平皿约 15ml，并转动平皿使之混匀，待营养琼脂凝固后备用。3.2同时将营养琼脂注入一个灭菌的空平皿内，做好标记后进行同条件培养，作为培养基的空白对照。备注：如该项目与菌落总数项目同批操作时，则该处空白对照与菌落总数的空白
45、对照合二为一即可。3.3采样点设置，通常为 5个，即室内墙角对角线交点为 1个采样点，该交点与四墙角连线的中点为另外 4个采样点。采样点的高度为 1.2-1.5m左右（略高于工作面） ，应远离墙壁 1m以上，并避开空调、门窗等空气流通处。3.4将营养琼脂平板置于采样点处，打开皿盖，暴露 15分钟，盖上皿盖，翻转平板，置于(361)的培养箱内培养(482)h，取出计数。4.计数：同菌落总数测定的计数方法。5.报告：每个平板上的菌落数均需记录于原始记录中，最后取其平均值以 cfu/平板伊利液态奶事业部微生物检验方法22进行报告。6、霉菌沉降具体方法、步骤同上，只是将其中培养基和培养条件更改为霉菌的
46、专用培养基和培养条件即可。7.其它同菌落总数测定中相应要求。（九）大肠杆菌（葡萄糖苷酶荧光）检验方法(SN 0333-94)1主题内容与适用范围本方法规定了食品中大肠杆菌的定量检验方法。本方法适用于出口食品（不包括贝类）卫生质量的监视和出口前的筛选检验。2 设备和材料2.1刻度吸管：1ml 和 10ml2.2试管：18mm180mm2.3稀释瓶：300ml 三角瓶2.4玻璃珠2.5均质器2.6水浴箱或培养箱：3612.7长波紫外光灯：366nm,功率6W3培养基和试剂3.1 LST-MUG肉汤：见 A13.2 Columbia-MUG琼脂培养基：见 A23.3生理盐水：见 A3备注：3.1、3
47、.2 所述药品可与厂家（陆桥）联系购买，也可按 A1、A2 说明配制。4样品制备4.1液体食品以无菌操作吸取检样 25mL放入装有 225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶,以 30cm幅度、于 7s内振摇 25次(或以机械振荡器振摇),制成 1:10的样品匀液。4.2固体和半固体食品以无菌操作取 25 g样品,放入装有 225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于 8000 伊利液态奶事业部微生物检验方法23r/min均质 12min,制成 1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。4.3稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列 10倍递增的样品稀释液,如 10-2、10 -3
48、、10 -4。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过 15min。5测定5.1每个样品选三个连续稀释倍数的稀释液，每个稀释倍数的稀释液接种三管 LST-MUG肉汤，每管 1ml。5.2 将接种管于 30分钟内放入 361水浴或培养箱内，培养 24h2h。5.3 将各管培养物拿至暗室，在长波紫外光灯照射下观察。凡显蓝色荧光的为大肠杆菌阳性，在阳性管上做好标记并记录。5.4 从产气而不显荧光的各管取培养物，划线接种 Columbia-MUG琼脂平板，361培养 24h2h。5.5 将培养后的 Columbia-MUG平板拿至暗室，打开皿盖，在长波紫外光灯照射下观察有无蓝色荧光。凡显蓝色荧光的，无论其面积大小，均记为 LST-MUG管培养物为大肠杆菌阳性。6 结果报告按 LST-MU
