1、SDS-PAGE 电泳技术 测定蛋白质的分子量,SDS-PAGE凝胶的制备 SDS-PAGE电泳 凝胶染色和脱色 蛋白质分子量的测定,电 泳,电泳是带电跟粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。 这现象在1808年就发现了，但是作为一项生物化学研究的方法学却是在1937年后，随着电泳仪器等装置的改进才有了较大的进展。然而，电泳真正在生物化学和其它领域的研究中得到广泛的应用，还是在用滤纸作支持物的纸电泳问世之后。60年代以来，由于采用了新型的支持物和先进的仪器没备，所以适合于各种目的的电泳便应时而生。,电 泳 的 种 类,1、显微电泳：显微电泳是用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为
2、的过程。目前此法已用于研究膜结构以及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。 2、自由界面电泳 ：胶体溶液的溶质颗粒经过电泳后，在胶体溶液和溶剂之间形成界面的电泳过程。 3、区带电泳：样品物质在惰性支持物上电泳的过程。常用种类有：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）、琼脂糖凝胶电泳、双向电泳等等。,聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide,Acr）和交联剂NN-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）以29:1的比例在聚合剂过硫酸铵(ammonium persulfate，A
3、PS)和催化剂TEMED的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。 优点：,凝胶孔径可调节（改变单体和交联剂的浓度），因此可根据被分离物的分子量范围选择合适的浓度灵敏度可达1mg分辨率高，可分离大小相差仅3%的多肽。尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体无电渗作用，只要纯度高，操作条件一致，样品分离重复性好凝胶透明，有弹性，机械效能好化学性能稳定，与分离物不发生化学反应; 对pH和温度变化较稳定,聚丙烯酰胺凝胶电泳种类,非变性PAGE 变性PAGE，如SDS-PAGE,SDS-PAGE电泳原理,聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依据是样品中各种物质的电荷和分子量
4、的差异性。 SDS与蛋白质结合后，蛋内质分子即带有大量的负电荷，并远远超越其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低乃至消除。 与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向致。 多肽与SDS结合的量几乎总成正比而与其序列无关。所以各种SDS蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映出分子量的差异。 在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。,SDS-PAGE的种类,连续SDS-PAGE 不连续SDS-PAGE,不连续聚丙烯酰胺电泳原理,不连续PAGE：Ornstein(1964) and Davis (1964)（1）凝胶层的不连续；浓缩胶浓度为2.5%-4
5、%，分离胶则根据被分离样品的情况而定。（2）缓冲液离子成分的不连续；在两层凝胶中加入前导离子，在电极缓冲液中加入尾随离子。为保持溶液的电中性及一定的pH，在缓冲液中加入一种与前导和尾随离子符号相反的离子，为缓存配对离子。在分离蛋白质样品时，常用的前导离子为Cl，甘氨酸根负离子为尾随离子，采用三羟甲基氨基甲烷（Tris）作为缓冲配对离子。（3）电位梯度的不连续：前导离子后面形成了高的电位梯度。当前导离子、尾随离子和蛋白质迁移率和电位梯度的乘积相等时，则三种离子移动速度相同。在前导离子和尾随离子之间形成一个稳定的不断向阳极移动的界面。也就是在高电位梯度和低电位梯度之间形成一个迅速移动的界面。 （4
6、）pH值的不连续：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续，这是为了控制尾随离子的解离度，从而控制其有效迁移率。要求在浓缩胶中，慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在前导和尾随离子界面之间，使样品浓缩。而在分离胶中尾随离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。,不连续PAGE电泳中浓缩胶的作用,连续缓冲系统样品和浓缩胶中含 Tris-HCl（pH 6.8）, 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH 8.3）。 样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界，而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位梯度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质
7、前移并在分离胶前沿积聚。 此处分离胶pH值较高，有利于甘氨酸的解离，形成的甘氨酸离子穿过堆积的多肽并紧随氯离子之后，在分离胶中泳动。SDS多肽复合物从移动界面中解脱开来，在电位和pH值均匀的区段泳动，通过分离胶的筛分作用按照分子大小不同得到分离。,不连续PAGE电泳中分离胶的作用,（1）分子筛作用：分子量大的蛋白质泳动的速度慢，分子量小的蛋白质泳动的速度快。 （2）电荷的作用：大部分的蛋白质在pH8.3电极 缓冲液的条件下带有负电荷，表面负电荷多的蛋白质迁移快，反之则慢。,SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理,蛋白质结合SDS的量，受溶液pH、离子强度和缓冲液组分的影响。 同时还受蛋白质中完
8、整二硫键的影响，即与蛋白质的种类有关。例如、糖蛋白和某些酶(如葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白酶以及胃蛋白酶等)与SDS的亲和力较低；又如溶菌酶在SDS作用下，其4对二硫键被打开，半径增加，因此测出的分子量是偏高的。,SDS-PAGE测定蛋白质分子量的影响因素,SDS-PAGE的有效分离范围,SDS-PAGE的有效分离范围取决于灌胶用聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下，丙烯酰胺只能聚合形成粘稠的溶液，经过双丙烯酰胺交联后才能使凝胶产生刚性和伸展性，并形成SDS多肽复合物必须通过的空隙。这些空隙的大小随双丙烯酰胺：丙烯酰胺比率的增加而变小。,SDS-PAGE的有效分离范围,注：丙烯酰胺：双丙烯
9、酰胺的分子比是1：29,实验方法,凝胶板的制备 点样及电泳 蛋白的染色和脱色 蛋白质分子量的测定,密封条,梳子,平，凹玻板,斜楔板,电泳槽,DYCZ-24D型垂直板电泳槽,聚丙烯酰胺凝胶的配制,贮液 分离胶（10%） 浓缩胶（5%） ddH2O 3.3 ml 2.77 ml 30% Acr/Bis 4.0 ml 0.83 ml 1.5M Tris pH8.8 2.5 ml / 0.5M Tris pH6.8 / 1.26 ml 10% SDS 100 ml 50 ml 10% APS 100 ml 50 ml TEMED 10 ml 10 ml Total volume 10 ml 5 ml,
10、20-37 30-45min,20-37 20-30min,按表中的顺序加入各溶液每加入一种溶液，立刻混匀TEMED加入之后聚合反应开始，应立即混匀并灌胶 聚丙烯酰胺具有很强的神经毒性，应带手套操作！,配胶步骤,安装玻璃板并放置胶条,加少许水到凹槽内测试两层玻板间隙是否漏液,吸取少量水加到分离胶液面上,标记上下层胶的界面：梳子下0.5-1cm处,倾去覆盖液，用滤纸将残余液吸去，注意勿破坏凝胶面,配制浓缩胶溶液，加过TEMED后，立刻灌胶,室温放置30min ，或37放置10-20分钟,室温放置30-45min，或37放置20-30分钟,取下玻璃板并抽出胶条,将电泳架放入电泳槽内，在内外槽 分别
11、加入电泳缓冲液直至没过上样孔, 缓慢取出梳子,上样：marker、样品，加入梳孔中,加上电泳槽盖，并连接电泳仪（注意正负极）,样品蓝色前沿（溴酚兰）进入分离胶后,调电压为150V,溴酚兰抵达凝胶底部，关闭电源，并取出玻板,在玻板和凝胶间注入水，小心剥离凝胶,标记分离胶方向，标记溴酚蓝前沿位置,在电压为90V的条件下开始电泳,电泳步骤,将带胶玻璃板转面再次固定到电泳架上（凹槽面朝内）,上样： 1.Marker 20 ml 2.蛋白A 10 ml 3.蛋白B 10 ml 4.蛋白C 10 ml 5.蛋白D 10 ml,考马斯亮蓝染色过夜、脱色2-3h，测量距离并照相,测量并计算分子量： 1. 测量
12、 溴酚蓝条带 距 分离胶上沿 的距离 2. 测量 Marker 各个条带 距 分离胶上沿 的距离 3. 测量 待测蛋白A、B、C、D 主要蛋白条带 距 分离胶上沿 的距离 4. 根据下列公式计算 蛋白相对迁移率 mR,5. 根据 Marker的各蛋白相对迁移率（mR, 横坐标）和各蛋白的分子量 Mr. 大小的对数值（IgMr, 纵坐标）绘制标准曲线 6. 根据待测蛋白主要蛋白条带的相对迁移率，计算待测蛋白 A、B、C、D 的分子量,Marker （中相对分子量标准参照物）蛋白质 分子量Mr 磷酸化酶B 97,400牛血清白蛋白 66,200 兔肌动蛋白 43,000碳酸酐酶 31,000 大豆胰蛋白酶抑制剂 20,100溶菌酶 14,400,P299,思考题,1.SDS-PAGE电泳的原理？ 2.PAGE的应用有哪些？,
